Enzimatik Sindirim ve Elle Ayrışma: C. elegans Embriyolarını Hücre Kültürüne Hazırlamak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Sangaletti, R. ve Bianchi, L. Embriyonik C. elegans Hücrelerini Kültürlemek İçin Bir Yöntem.J. Vis. Uzm.(2013).

Bu videoda, embriyonik C. elegans hücrelerinin in vitro olarak izole edilmesi ve steril olarak kültürlenmesi için bir yöntem tanıtılmaktadır.

Protokol

1. Embriyonik Hücrelerin Ayrışması

1. Prosedürün sonraki adımlarını bir laminer akış başlığı kullanarak steril koşullar altında gerçekleştirin. Hayvanlar bakteri plakaları üzerinde giydirilirken, yıkamalar ve ağartıcı içeren lizis solüsyonu ile tedavi, bakterilerin tümünü olmasa da çoğunu ortadan kaldırmalıdır. Bu nedenle, prosedürün bu noktasında bir laminer başlık kullanmak, yumurta süspansiyonunun yeni kontaminasyonunu önler.
2. Peletlenmiş yumurtaları 1 ml 2 mg / ml kitinaz (yumurta tamponu pH 6.5'te stok) içinde yeniden süspanse edin ve bunları yeni bir steril 15 ml konik tüpe aktarın. Tüpü oda sıcaklığında 10-30 dakika sallayın. Kesin inkübasyon süresi, enzimin tazeliğine ve odanın sıcaklığına göre değişir ve bu nedenle her preparat için belirlenmelidir. 10 dakikalık inkübasyondan sonra yumurtaların ters çevrilmiş hücre kültürü mikroskobu altında izlemeye başlanması önerilir. Not: Deneyimlerimize göre, düşük pH kitinaz enzimatik aktivitesini arttırır. Bu nedenle, kitinazı çözmek için pH 6.5'te yumurta tamponu kullanıyoruz (yukarıda bildirilen tarif, pH'ın NaOH kullanılarak 6.5'e ayarlandığı yerde).
3. Yumurta kabuklarının ~% 80'i kitinaz tedavisi ile sindirildiğinde (Şekil 1 AB), yumurtaları 3 dakika boyunca 900 x g'da (~ 2.500 rpm) santrifüjleme ile peletleyin. Bir P1000 pipetleyici ve steril uçlar kullanarak, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 3 ml L-15 ortamı ekleyin.
4. Yumurtaları 6 cm çapında bir plakaya aktarın ve 18 G'lik bir iğne ile donatılmış 10 ml'lik steril bir şırınga kullanarak hücreleri nazikçe ayırın. Taze bir plastik Petri kabına bir damla süspansiyon koyarak ve mikroskop altında görüntüleyerek ayrışma derecesini izleyin. Hücrelere zarar vermemek için bu prosedür sırasında şırıngaya hava aspire etmeyin. Hücrelerin ~% 80'i ayrışana kadar ayrışmaya devam edin.
5. Steril bir 5 μm Millipore filtre kullanarak süspansiyonu filtreleyin. Hücre kümelerini, sindirilmemiş yumurtaları ve yumurtadan çıkmış larvaları uzaklaştırmak için hücre süspansiyonları filtrelenmelidir. Tüm hücreleri geri kazanmak için ek 4-5 ml taze L-15 ortamını filtreden süzün. Filtreye ve/veya hücrelere zarar vermemek için filtreleme adımı sırasında aşırı güç uygulamayın.

2. Kültür Hücreleri

1. Ayrışmış hücreleri 3 dakika boyunca 900 x g'da (~ 2.500 rpm) santrifüjleme ile peletleyin. Bir P1000 pipetleyici ve steril uçlar kullanarak tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın. Peletlenmiş hücreleri tam L-15 ortamında ve plaka 1 ml / kuyuda yeniden süspanse edin. Eklenen ortamın miktarı 8P sayısına bağlıdır kullanılan plakalar, solucanların plakalar üzerindeki birleştiği yer ve hücreler üzerinde yapılacak deneylerin türü. Hücre yoğunluğu bir hemositometre kullanılarak belirlenebilir. Yama kelepçeli kayıtlar için ~ 230.000 hücre/^cm2 kaplama yoğunluğu en uygunudur.
2. Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için 24 kuyulu plakayı ıslak kağıt havlu içeren plastik bir Tupperware kabında saklayın. Kabı nemlendirilmiş bir inkübatörde 20 °C'de ve ortam havasında saklayın.
3. Hücreler genellikle GFP belirteçlerinin morfolojik farklılaşması ve ekspresyonu tamamlandığında 24 saat içinde deneyler için hazır hale gelir. Hücreler kültürde 2 haftaya kadar tutulabilir, ancak genellikle kaplamadan 7-9 gün sonrasına kadar en sağlıklıdırlar. Sağlıklı hücreleri korumak için ortamın günde bir kez değiştirilmesi gerekir.

Sonuçlar

Şekil 1. C. elegans kitinaz tedavisinden önce ve sonra embriyolar. (A) Kitinaza maruz kalmadan önce yumurtaların fotoğrafı. Ok, bir embriyoyu çevreleyen şeffaf ve sağlam yumurta kabuğunu gösterir. (B) 10 dakika boyunca kitinaz ile tedavi edilen yumurtalar. Yumurta kabukları sindirilmiştir ve artık embriyoların etrafında görünmezler. Oklar, yumurt...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
REAGENTS
Leibovitz'in L-15 Orta (1x) Sıvısı	Canlandırıcı	11415-064
Fetal Sığır Serumu	Canlandırıcı	16140-063
Penisilin-streptomisin	Sigma	P4333-100ML
Kitinaz	Sigma	C6137-25BM
Fıstık Lektini	Sigma	L0881-10MG
>EKİPMAN
101-1000 μl Mavi Dereceli Pipet Uçları	ABD Scentific	1111-2821
10 ml Ayrı Ayrı Sarılmış Sterilize Pipet	ABD Scentific	1071-0810
Ergonomik Değişken Hacim (100-1000 μl) Uç çıkarıcılı pipetleyici	VWR Uluslararası A.Ş.	89079-974
Taşınabilir Pipet Yardımı, Drummond	VWR Uluslararası A.Ş.	53498-103
Transfer Plastik Pipet Steril	VWR Uluslararası A.Ş.	14670-114
15 ml Konik Tüp	ABD Scentific	1475-1611
Steril 18 gauge İğneler	Becton, Dickinson ve Co.	305196
Steril 10 ml Şırınga	Becton, Dickinson ve Co.	305482
Plastik Şırınga Filtreleri Corning 0,20 μm gözenek boyutu	Corning	431224
Akrodik 25 mm Şırınga filtresi, 5 μm versapor Membranlı	VWR Uluslararası A.Ş.	28144-095
60x15 mm Petri Kabı Steril	VWR Uluslararası A.Ş.	82050-548
100x15 mm Petri Kabı Steril	VWR Uluslararası A.Ş.	82050-912
12 mm Çaplı Cam Lameller	VWR Uluslararası A.Ş.	48300-560
Şeffaf Hücre Kültürü Plakaları 24 Kuyulu Düz Tabanlı kapaklı	Thomas bilimsel	6902A09
Dumont #5- İnce Forseps	Güzel Bilim Araçları	11254-20
Santrifüj 5702	Eppendorf Belediyesi	22629883
Laminer Akış Başlığı
x10 objektifli Ters Mikroskop
Ortam havası nemlendirilmiş İnkübatör