C. elegans Hareket İzleme: Solucanlarda Hareketi Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Davies, A. G. et al. Etanolün Caenorhabditis elegans'ın Hareket Hızı Üzerindeki Etkilerini Ölçmek İçin Bir Deney.J. Vis. Uzm.(2015).

Bu videoda, bir arenada solucan hareketini kaydetmek için video ve izleme yazılımının kullanımı açıklanmaktadır. Örnek protokol, etanol maruziyetinin solucan hareketi üzerindeki etkisini ölçer.

Protokol

Aşağıdaki protokol, Davies ve ark. Etanolün Caenorhabditis elegans'ın Hareket Hızı Üzerindeki Etkilerini Ölçmek İçin Bir Test, J. Vis. Exp. (2015).

1. Testten Önceki Gün Gerçekleştirilecek Adımlar

   1. OP50 E. coli çimi ile tohumlanmış taze nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarına L4 aşama solucanlarını seçin ve 20 ° C O / N'de kültürleyin. Her tahlil koşulu 10 solucan gerektirir; O/N solucan kaybına izin vermek için fazla solucan toplayın.
      1. Sadece ilk gün yetişkinleri olan hayvanları test edin; birçok mutant, vahşi türden daha yavaş bir hızda büyür. Gelişimsel gecikmeleri olan suşlar için toplama zamanlamasını, test edilen tüm hayvanların ilk gün yetişkinleri olacak şekilde ayarlayın.
2. Test gününde gerçekleştirilecek adımlar
   1. Tahlil için hazırlık:
      1. Standart çekirdeksiz 60 x 15 mm NGM plakaları üzerinde tahliller yapın. Kullanılacak tüm plakaları kapakları kapalı olarak 37 °C'de 2 saat kurutun. Her deneysel deneme için dört kurutulmuş NGM plakası kullanın; bunlar 0 mM ve 400 mM etanol tahlil plakaları ve bunlara eşlik eden iklimlendirme plakaları olacaktır.
         NOT: NGM plakalarının kullanımı burada önemlidir; Plakaların bileşimindeki farklılıklar, özellikle ozmolariteleri, etanolün davranış üzerindeki doz tepkisini güçlü bir şekilde etkileyebilir, bu, en azından kısmen, hayvanlar tarafından biriken etanol miktarındaki değişikliklerden kaynaklanmaktadır. NGM agar 160 mOsm'dir.
      2. Kuruduktan sonra, tahlilde kullanılacak tohumlanmamış NGM plakalarının her birini tartın ve ağırlığı not edin. Boş bir plakanın ağırlığına bağlı olarak plakalardaki ortamın hacmini belirleyin. Agarın ağırlığının hacme dönüşümünü yaklaşık olarak tahmin etmek için, ortamın eşit hacimde su ile aynı ağırlığa sahip olduğunu varsayalım.
         NOT: En tutarlı sonuçlarımız, orijinal 10 ml'lik bir hacmin kurutma sonrası hacmi 8,3-8,9 ml arasında olacak kadar dehidre edilmiş NGM ortamında bulunmuştur. 2 saatlik kuruma süresine bir alternatif, inkübatörlerdeki farklılıkları hesaba katmak için plakalar bu hacim aralığına ulaşana kadar kurutmaktır.
      3. 4 bakır halkayı (iç çapı 1,6 cm) farklı genotipler veya solucan tedavi grupları için ağıl görevi görecek şekilde plakaların her birinin yüzeyine eritin. Her halkayı forseps ile kavrayın ve yaklaşık 3 saniye boyunca bir alevde ısıtın (bir Bunsen brülöründen gelen güçlü bir alev iyi çalışır). 'Atlamasını' önlemek için yüzüğü forseps ile tutarken halkayı hemen bir tabağa yerleştirin.
         1. Halkanın birkaç noktasında forseps ile hafifçe bastırarak halkanın agar yüzeyine düz bir şekilde oturduğundan emin olun. Yüzüğü yerleştirirken, ek üç yüzük için yer bırakmaya dikkat edin.
         2. Ek üç bakır halkayı plakanın yüzeyine eritin ve dördü de kameranın görüş alanında olacak şekilde mümkün olduğunca birbirine yakın yerleştirmeye dikkat edin.
            NOT: Agar ile iyi bir sızdırmazlık sağlamak, tahlil sırasında solucanları halkalarda tutmak için çok önemlidir. Plaka üzerinde atlayan halkaların agar ile doğru sızdırmazlığı yapması pek olası değildir ve agarı yaralayabilir, bu da solucanların yuva yapmasına izin verir ve solucanların görselleştirilmesini engeller.
         3. Her tahlil plakası için, kurutulması ve tohumlanmaması gereken ve etanol almayacak olan bir "iklimlendirme" plakası hazırlayın. Bu plakalara dört bakır halka yerleştirin.
      4. Her halkanın yanındaki plakaların alt kısmını, halkanın kendisinin görüş alanına yazmamaya dikkat ederek, halkada kullanılacak solucan türü ile etiketleyin. Tahlil plakası üzerindeki etiketleri, beraberindeki iklimlendirme plakası ile eşleştirin.
      5. Nihai konsantrasyon 0 mM veya 400 mM etanol (ağırlık/hacim) olacak şekilde her bir tahlil plakasına eklenecek %100 etanol miktarını hesaplayın. Her deney için (n = 1), bir adet 0 mM ve bir adet 400 mM etanol plakası olacaktır; İklimlendirme plakaları etanol almaz. Etanolü ekleyin, plakanın yüzeyine pipetleyin. Plakayı kapatmak için laboratuvar filmi kullanın ve 2 saat boyunca tezgah üstünde dengelenmesine izin verin.
      6. 1,5 saat geçtiğinde, testin alışma adımına, adım 2.2'ye başlayın.
   2. Hareket tahlili yapın: Test plakaları
      1. Her deney grubunun 10 solucanını, iklimlendirme plakası üzerindeki bir bakır halkanın merkezine dikkatlice aktarın. Bu noktada agar üzerinde görünen yiyecekleri solucan penası ile hafifçe kazıyarak çıkarın. Deney gruplarının deneysel denemeler boyunca plakalara yerleştirilme sırasını, aynı suşların denemeler boyunca aynı sırayla plakalara konmaması için değiştirin.
         NOT: Amaç, hayvanları minimum miktarda yiyecekle tabağa aktarmaktır, çünkü iklimlendirme plakasındaki yiyecekler tahlil plakasına aktarılırsa, solucanlar yiyeceğin etrafında toplanacak ve ilacın hareket üzerindeki etkisi gizlenecektir.
      2. Agarın yüzeyini kazma ile kırmamaya dikkat edin, çünkü bu solucanların yuva yapmasına izin verecek ve tahlili bozacaktır. Solucanları RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
      3. Her plakanın başlangıçları arasında uygun bir aralık olduğundan emin olun. Deneyimli bir deneyci, 1,5 dakikalık < sürede 4 halka için 10/halka olmak üzere 40 hayvanı hareket ettirebilir, ancak 2 dakikaya kadar herhangi bir aralık kabul edilebilir. Standart tahlil, hem 0 mM hem de 400 mM etanol için 10-12 dakika ve 30-32 dakika maruz kalma hızında film kaydına sahiptir.
      4. 0 mM pozlama için iklimlendirme plakasını ve 400 mM pozlama için iklimlendirme plakasını yaklaşık 2 dakika 30 saniye arayla başlatın, böylece ilk film dosyasının ikinci film başlamadan önce kaydedilmesine izin verin.
      5. 30 dakikalık alıştırma süresinden sonra, solucanları alıştırma plakalarından tahlil plakalarına aktarın. Solucanları tahlil plakalarına (0 mM veya 400 mM etanol) iklimlendirme plakasına eklendikleri sırayla aktarın ve her bir plakanın tamamlanması arasındaki zamanlamayı takip edin. Buharlaşma nedeniyle etanol kaybını en aza indirmek için plakayı laboratuvar filmi ile kapatın.
      6. Düzleştirilmiş penanın üzerindeki solucanları toplamak için ince kenarlı düzleştirilmiş bir solucan penası ile bir kepçe hareketi kullanın. Solucanların tohumlanmamış iklimlendirme plakasından tahlil plakasına transferini, solucanın kazmaya yapıştırılmasına yardımcı olduğu için solucanların transferinde yaygın olarak kullanılan bakteri kullanmadan gerçekleştirin.
         NOT: Hayvanların bu aşamada transfer edilme hızı çok önemlidir, çünkü plakadaki ilk solucanlar, plakaya eklenen son solucanlardan daha uzun süre etanole maruz kalacaktır ve daha önceki zaman noktaları zamana bağlı bazı etkiler gösterebilir. Bu, deneysel kopyalar arasında ilk olarak bir plaka üzerine yerleştirilen suşların dönmesinin ana nedenidir.
   3. Hareket Testi Gerçekleştirin: Çekim
      1. 0,5x mikroskop objektifi, 0,8x büyütme ve 2048x2048 7,4 μm piksel CCD'ye sahip bir kamera gibi görüş alanındaki dört halkanın tümünün (yaklaşık 42x42 mm² kare) aynı anda görüntülenmesine izin veren bir mikroskop/kamera kombinasyonu kullanın.
      2. Yoğunluk eşiği adımında nesne tanımaya yardımcı olan görüş alanı boyunca eşit aydınlatma kullanın. 3 "x3" arka ışık iyi çalışıyor.
      3. Solucanları, geleneksel mikroskopla iletilen bir ışık kaynağına kıyasla arka ışığı kullanırken kaybolan kontrastı oluşturan, medya tarafı yukarı (kapak aşağı) yerleştirilmiş bir plaka üzerinde görüntüleyin.
      4. Hareket eden solucanların hızlandırılmış videolarını çekmek için görüntü analiz yazılımını hazırlayın. Yazılımı, her 1 saniyede bir, 2 dakikalık (120 kare) bir film olarak 12 bit gri tonlamalı görüntüler çekecek şekilde ayarlayın. Çıktı dosyasının boyutunu küçültmek ve yeterli görüntü çözünürlüğünü korumak için, 1024x1024 piksellik görüntüler yakalamak üzere 2x2 gruplama modunu kullanın.
      5. Filmleri kaydedin. Son solucanlar o plakaya yerleştirildikten 10 dakika sonra ilk plakanın (0 mM etanol) 120 karelik bir filmini kaydetmeye başlayın. Film dosyasını kaydedin.
      6. İkinci plakayı kaydedin (400 mM etanol). Her pozlama için 30-32 dakikalık zaman noktalarını yakalamak için son solucanların ilk plakaya (0 mM etanol) yerleştirilmesinden 30 dakika sonra başlayarak bu işlemi her iki plaka için de tekrarlayın.
         NOT: Analiz edilecek bir sonraki plakanın kaydına başlamadan önce her yakalama oturumundan sonra görüntü dosyalarını kaydetmek için yeterli zaman tanıyın.
      7. Arşivlenmiş filmlerin geleceğe hazır hale getirilmesi ve bu filmlerin ImageJ gibi diğer kamuya açık açık kaynaklı görüntüleme yazılım programları tarafından açılmasına ve analiz edilmesine izin vermek için, her filmin bir kopyasını 8 bit 256 gri tonlamalı TIFF dosyalarına dönüştürün.
         NOT: Burada açıklanan görüntü analizi yazılımı, özel bir dosya biçimi kullanır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C. elegans suşları	Caenorhabditis Genetik Merkezi
60 x 15 mm Petri plakaları, üç bacalı	Greiner Bio-Bir	628161	Diğer tabak markaları yeterli olacaktır.
NGM agar	çeşitli		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), pepton (2.5 g/L), 1 ml kolesterol (etanol içinde 5 mg/ml), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forseps	çeşitli		Örneğin, Fisher Scientific #10300
37 °C Kuluçka Makinesi	çeşitli		Agarı kurutmak için
Bakır yüzükler	Tesisat ustası	STK#35583 (48 kapaklı dişli conta)	1,6 cm iç çap, 1,8 cm dış çap bakır yüzükler
%100 etanol	çeşitli
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD kamera	Hayal Etme	RET-4000R-F-M-12	Bu kamera geniş bir görüş alanına sahiptir.
C montajlı ve 0,5X objektifli stereomikroskop	Leica Belediyesi	MZ6	Üretimi durdurulan model, M60 mevcut eşdeğeridir.
Işık kaynağı	Schott	A08923 (İngilizce	Görüş alanı boyunca eşit aydınlatma için 3 "x3" arka ışık
Görüntüleme ve izleme yazılımı	Medya Sibernetik	ImagePro Plus v6.0-6.3	Yazılımın daha yeni sürümleri izleme işlevlerine sahiptir.