Metabolomik için Numune Hazırlama: Metabolit Profili Oluşturma için Hücre Numuneleri Hazırlama Yöntemi

Abstract

Kaynak: Zhao, YC ve diğerleri, Meme Kanserinde Östrojen Reseptör Sinyali ile Metabolik Düzenlemenin Sistem Biyolojisi. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu videoda, metabolit profili oluşturma için meme kanseri hücresi örneklerinin hazırlanmasına yönelik bir teknik açıklanmaktadır. Meme kanseri hücreleri, östrojen reseptörü alfa'ya bağlanan ve metabolit bileşiminde değişikliğe neden olan estradiol ile tedavi edilir.

Protocol

1. Metabolomik Test Numunesi Hazırlama

1. Hücre Kültürü ve Tedavisi
   1. Büyüme ortamında 10 cm'lik plaka başına 400.000 MCF7 hücresi tohumlayın. Her tedavi için üç numune hazırlayın. Tespit için yeterli hücre almak için her numunede iki plaka kullanın. 3. günde, ortamı çıkarın ve hücrelere ^10-8 M Estradiol veya E2 ile veya olmadan 5 ml taze ortam ekleyin. Hücreleri 24 saat tedavi edin (nemlendirilmiş% 5 CO₂ atmosferinde 37 ° C).
2. Numune Toplama
   1. Plakaya 5 ml buz gibi soğuk 1x PBS ekleyin, plakayı birkaç kez kısaca eğdikten sonra PBS'yi aspire edin. İki kez tekrarlayın ve son yıkamadan sonra mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarın.
   2. Her plakaya 750 μl ön soğuk aseton ekleyin ve hücreleri kazıyın. Aseton içindeki hücreleri iki plakadan buz üzerinde 2 ml'lik bir tüpte birleştirin.
   3. Normalleştirme için hücre sayısı
      1. Her tedavi için, hücre ölçümü için iki ekstra plaka kullanın. Hücreleri plakadan ayırmak için, her plakaya 2 ml HE tamponu (1x HBSS, 10 mM HEPES,% 0.075 NaHCO₃ ve 1 mM EDTA) ekleyin ve 5 dakika inkübe edin.
      2. Hücreleri HE tamponunda pipetleyerek hücreleri toplayın ve iyice karıştırın. Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını saymak için toplam 20 μl hücre çözeltisi kullanın.
3. Gaz kromatografisi kütle spektrometresi (GC-MS) analizi kullanarak metabolitleri tanımlamak ve miktarını belirlemek için Metabolomik merkezine göndermeden önce numuneleri -80 °C'de saklayın.