Karşılaştırmalı In vivo Eğitim Xenopus laevis</em

Özet

Kurbağa Xenopus laevis Antijen-spesifik CD8 T hücre yanıtları teşvik etmek gibi gp96 ısı şoku proteini yeteneği keşfetmek için cazip bir alternatif olmayan memeli modeli sağlar. Biz yöntemleri eğitim sunmak In vivo Gp96 tarafından cilt ve tümör antijenleri çapraz sunum kolaylaştırma.

Özet

Amfibi Xenopus geliştirilen chaperoned antijenlerin çapraz sunum kolaylaştırmak ve doğal ve adaptif T hücre tepkiler. Xenopus deri grefti reddi gibi gp96 olarak belirli bir ısı şok proteinleri (HSP) yeteneği çalışma olmayan eşsiz bir memeli modeli laevis klasik MHC sınıf Ia (sınıf Ia) kısıtlı T hücre yanıtlarını ortaya çıkarmak için gp96 yeteneğini araştırmak için mükemmel bir platform sağlar. Ayrıca, Xenopus model sistem, böylece bağışıklık gözetim kaçan kendi sınıf Ia molekülleri aşağı düzenlenmiş tümörlere karşı tepkiler oluşturmak için gp96 yeteneği keşfetmek için farelere de cazip bir alternatif sağlar . Son zamanlarda, peritoneal lökosit antijen sunan hücreler (APC) olarak kullanarak Xenopus klonları bir evlatlık hücre transferi tahlil ve gösterdi ki küçük histokompatibilite cilt antijenlere karşı yanı sıra, Xenopus timik tümör 15 karşı in vivo gp96. Başbakan CD8 T hücre yanıtlarını sınıf Ia molekülleri ifade etmez / 0. Burada periton lökositlerin ortaya çıkarma, attığı evlatlık transferi, yanı sıra deri grefti ve tümör nakli deneyleri dahil olmak üzere bu testleri gerçekleştirmek için ilgili metodoloji açıklanmaktadır. Ayrıca biz de, periferik kan lökositleri akım sitometri ve cilt ret ve anti-tümör cevapların yer efektör nüfus daha fazla karakterizasyonu için izin proliferasyon deneyleri için kullanılan toplama ve ayırma nitelendiriyor.

Protokol

1. Hayvanlar

X. laevis x X Gilli melezleri LG-6 ve LG-15 isogenetic klonlar ¹ University of Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm) üreyen koloni. LG-6 ve LG-15 payı aynı heterozigot MHC haplotip (a / c), ancak küçük histokompatibilite (H) lokusların farklı. Bu klonlar Döl diploid yumurta dişi tarafından üretilen UV ışınlanmış sperm (döl hiçbir DNA katkısı) tarafından aktive edildiği gynogenesis tarafından üretilmektedir.

Eldiven kullanımı fakültatif. Bazı insanlar kurbağaların işlemek için daha zordur (kaygan) ve aslında kurbağaları rahatsız görünüyor, çünkü onları giymek için tercih ediyor.

2. Tümör 15 / 0 (tümör H-Ag Minor ifade) saflaştırılması gp96

Gp96 arıtma, ^{daha önce 2,} 3 tarif edilmiştir. Kısaca, gp96 CONA-sepharose ve DEAE kromatografisi% 50-70 amonyum sülfat fraksiyonasyon arındırılır. Protein, 20-50 mg 1 ml tümör dokusu başına elde edilebilir. Hazırlık Saflık SDS-PAGE ve şerit boyama tarafından belirlenir.

3. Minör H-Ag-LG-6 Kurbağalar birbirinden farklı Periton lökositler (PL) ortaya çıkarılması ve Hasat

1. 25 ml gecede E. büyütün 37 50 ml konik bir tüp içinde Coli kültür ° C sallayarak ile .
2. Ertesi gün ısı 1 saat kaynatarak bakterileri öldürmek.
3. E. öldürülen ısı Santrifüj 2,000 rpm (1.500 g), 4 ° C 15 dakika için Coli
4. Süpernatantı ve 1 / 10 ^th APBS özgün kültür hacmi (2,5 ml) bakteriyel pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Bu noktada bakteri kültürü kullanıma hazırdır ve 24 saat içinde kullanılması gerekir.
5. Intraperitoneal (ip) 200 (2 inç kurbağa için) veya 25 gauge 5 / 8 iğne kullanarak kurbağa ortalama ısı ile öldürülmüş bakteri hazırlık 300 mcL (3 inç kurbağa için) enjekte edilir.
6. Intraperitoneal lavaj enjeksiyon PL üç gün sonra hasat edilir.
7. PL hasat önce tüm hareketleri geçene kadar (süre boyutu ve yaş bağlıdır), erişkin kurbağalar, 5 dakika kadar sodyum bikarbonat ile tampon tricaine metan sülfonat (TMS, MS-222),% 0.1 'lik sulu çözelti daldırma tarafından anestezi. Hayvanlar tedaviden sonra 10-20 dakika içinde uyanıyorum.
8. Kurbağa karın% 70 etanol küçük bir miktarı ile dezenfekte edin.
9. 5 ml (2 inç kurbağa için) ya da 10 ml steril APBS oda sıcaklığında 18 gauge 1 ½ iğne kullanarak periton boşluğuna önceden ısıtılmış (3 inç kurbağa için) enjekte edilir. İğneyi çıkarın ve vücut boşluğunda sıvı enjekte tampon equilibrates sigortalamak için bir dakika kurbağa hafifçe masaj yapın.
10. Temiz bir 50 ml konik tüp içine iğne arka damla periton sıvısı toplamak için bir şırınga olmadan yeni bir 18 gauge 1 ½ iğne kullanın. Ilk enjekte edilen hacim olarak mümkün olduğunca çok almak emin olun. , Karın bölgesi, merkezi bir bölgede kan damarları önlemek için dikkatli olun.
11. Onun kafesine geri konabilir bu noktada uyanık kadar sığ su ile bir kap içinde bir kez PL kurbağa hasat edilir.

4. Lg-6 Pls Naive Lg-6 Alıcılar içine attığı Kabul edilmiş Transferi

1. PL soğuk APBS ile bir kez yıkayın ve 10 dakika 4 ° C için 1.000 rpm (750 g) santrifüj
2. Süpernatantı ve APBS PL tekrar süspansiyon haline getirin.
3. 5 x 10 ⁵ PL başına 1 mg gp96 bir konsantrasyon gp96 PL Pulse.
4. Gp96 uygun miktarda PL eklendikten sonra 1 saat pipeting ve buz üzerinde inkübe karıştırın.
5. Bağlanmamış gp96 kaldırmak için 1000 rpm 10 dakika 4 ° C ya da 1 dakika 14.000 rpm'de hücreleri santrifüjleyin.
6. Hiçbir kalıntı gp96 sol olmadığından emin olmak için soğuk APBS 3X PL yıkayın.
7. Darbeli PL 300 mcL başına 5 x ⁵ 10 PL bir konsantrasyon tekrar
8. PL Adoptively 25 gauge 5 / 8 iğne kullanarak ip enjeksiyon yoluyla aktarın. Darbeli PL (5 x 10 ⁵ hücre) hayvan başına 300 mcL enjekte edilir.
9. Kurbağalar, deri grefti ya da tümör meydan deneyleri ile devam etmeden önce en az 3 gün astarlanmalıdır gerekir.

5. Cilt Greft Testi

Deri grefti reddi Xenopus ^{4, 5, 6,} köklü bir testtir. Xenopus, alıcının, 21-22, 18-22 gün içinde 1 veya 2 MHC haplotip uyumsuzlukları displaying bağış deri ° C reddeder Buna karşılık, LG-6 ve sadece küçük H-Ag tarafından farklı LG-15 klonları arasında deri grefti (fazla 30 gün olduğunu) daha yavaş reddedilir. Ancak, bu ret alıcıları tha hızlanırt önceki bir deri grefti ya da donör arınmış gp96 ile bağışıklama ya donör küçük H-Ag karşı astarlanmış edilmiştir. Hiç ret verici ve alıcının genetik (klonlanmış, örneğin ya da tamamen kendilenmiş hayvanlar) aynı zaman oluşur. Bu nedenle, bu basit tekniği, in vivo immün yanıtları karakterize gp96 tarafından ortaya çok güçlü .

1. 3.7 'de açıklandığı gibi donör kurbağa anestezisi.
   Not: Xenopus toplam aseptik işlemler için ihtiyacı ortadan kaldırır ciltte güçlü anti-mikrobiyal peptidler (örneğin, magainin) üreten bu yana sadece minimum önlemler alınması gerekir. Aslında, herhangi bir dezenfektan ile kurbağa tedavisi, cilt için zararlı olacaktır. Buna ek olarak, insanlar için transfer edilebilir herhangi bir patojenlerin Xenopus zorunda değilsiniz . Bu nedenle, eldiven kullanımı isteğe bağlıdır. Ancak, kullanılan tüm diseksiyon aletleri otoklava gereken ve tüm çözümler, steril olması gerekir.
2. Makas kullanarak LG-15 donör kurbağa ventral deri parçası (irridophore pigmentli hücrelerin varlığı nedeniyle gümüşi görünen karın cilt) (X 5 mm 20 mm) kesin ve küçük bir çıkarın.
3. Petridish içeren APBS cilt koyun ve buz üzerinde tutmak. Çok nazik deri dokusunun işleyin; forseps arasında tutarak önlemek.
4. Bir jilet veya makas kullanmak, 5 mm X 5 mm adet bireysel greft içine kesti. Buz üzerinde APBS parçaları tutun.
5. Bu noktada uyanık antibiyotikler (5 mg / L konsantrasyonu az Penstrep) içeren su konur ve ardından kadar donör kurbağa sığ su ile bir kap konur. Kurbağa, iki gün boyunca normal su döndürülür noktası antibiyotik ile su tutulur. Cilt kaldırıldı yerinde küçük bir yara dikili olması gerekir ve bir hafta içinde iyileşir değildir.
6. Alıcı LG-6 kurbağa anestezisi.
7. Alıcının dorsal (arka) cilt üzerinde küçük bir kesi yapın ve gümüşi tarafı ile cilt altında 5 mm x 5 mm greft yerleştiriniz. Deplasman hatta greft kaybına yol açabilir, çünkü cilt altında büyük hava kabarcıkları tanıtmak için değil, dikkatli olun.
8. Puanlama başladığında bu greft reddi olarak sayılmaz çünkü greft makas ve forseps işaretler not emin olun.
9. 24 saat sonra kaplanacağı ana cildin bir parçası greft kaldırılması gerekiyor.
10. Alıcı LG-6 kurbağa anestezisi. 5.1 'de açıklandığı gibi hayvan tutun.
11. Greft serbestçe görüntülenmiştir böylece otoklavlanmış makas kullanılması greft etrafında bir pencere kesip. Donör cilde dokunmak veya kanamaya neden dikkatli olun. 5.5 'de açıklandığı gibi kurbağa kurtarmak olsun.
12. Bir kroki alarak greft puanlama hemen başlayın. Cilt greft reddi aşılı cilt irridophores imha yüzde belirlenir.
13. Greftler, her 2-3 günde bir kontrol edilmesi gerekiyor, ancak bu hayvanların anestezi gerekmez. Greft görselleştirmek için, kurbağa diseksiyon mikroskobu altında bir petridish yerleştirilmesi gerekir.

6. Tüm montaj nakledilen Cilt İmmunohistolojik

Kurbağa bütün montaj İmmunohistolojik daha önce ⁶ tarif edilmiştir. Kısaca, kurbağa, anestezi ve steril bir kağıt havlu üzerine kurbağa su (çalışma alanı da aseptik olarak hazırlanmış) ile ön ıslak mikroskop altında yerleştirilir. Nakledilen deri daha sonra ev sahibi cilt çevreleyen küçük bir miktar ile birlikte hasat ve benzer antikorların akış sitometri analizi ⁶ için hücre boyama ile boyandı. Otoklavlı aletleri ve steril tamponlar kullanılması gerekir. Deri boyama sonra bir mikroskop lamı üzerine yerleştirilir ve yavaşça bir kapak kayma ile bastırdı. Bu noktada deri grefti sızmışlar farklı hücre popülasyonlarının floresan mikroskop kullanılarak görüntülendi olabilir. İşlemden sonra kurbağa bölüm 5.5 'de açıklandığı gibi, antibiyotik ile su tutulur. ve normal su döndü. Cilt kaldırıldı bıraktığı yerde küçük bir yara, bir hafta içinde iyileşir.

7. Kan lökosit Karakterizasyonu

1. Kurbağa kan çıkarmadan önce, bir ateşte steril Pasteur pipetler çekerek "cam iğneler" hazırlamak gerekiyor. Pipet ince ekstremite stereomicroscope altında bilenmiş. Pipet sonra bir aspirasyon plastik tüp bağlıdır.
   Forseps ve makas gibi tüm araçları kullanmadan önce otoklava gerekir.
2. Ayrıca APBS, 1 ml başına heparin 50 ünite ekleyerek APBS ve heparin çözüm buz 10 ml hazırlamak. Çözüm buz üzerinde tutun. Kullanılan tüm çözümler, steril olması gerekir.
3. 3.7 'de açıklandığı gibi kurbağa anestezisi, ve 5.1' de açıklandığı gibi aynı hayvan işlemleri uygulayın. .
4. Kes cilt ortaya çıkarmak için arka ayak üstündedorsal tarsus ven.
5. 1-2 mL APBS + heparin çözüm Pasteur pipeti ile doldurun.
6. "Cam iğne" damar içine yerleştirin ve yavaş yavaş ağız ile aspire kan toplamaya başlar. Bu alınan kan pıhtılaşmasını ve iğne ucu tıkanmasını önlemek çünkü "cam iğne" APBS + heparin çözüm olması önemlidir.
7. 1 2 mL kan, bir ortalama büyüklükteki kurbağa elde edilebilir.
8. Kurbağa bacağı üzerinde küçük bir kesi dikilir olması gerekmez ve bir hafta içinde yara iyileşir.
9. 1000 rpm'de 10 dakika süreyle kan Santrifüj 4 ° C
10. Süpernatantı ve soğuk APBS 10 ml 1X hücreleri yıkayın.
11. Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma), kırmızı kan hücreleri kan lökosit ayırmak için oda sıcaklığında önceden ısıtılmış 1 ml üzerine kan Yerleşimi 2 mL (1-5 x ^{10 6} hücre) .
12. Herhangi bir fren ile oda sıcaklığında 1000 rpm'de 20 dakika santrifüj, ve sonra lökosit bant toplamak.
13. 4 10 dakika 1400 rpm'de santrifüj yoluyla APBS ile 2X hücreleri yıkayın ° C kalan Ficoll kaldırmak.
14. Bu noktada hücreler flow sitometri analizi için antikorlar ile boyanarak hazır, ya da in vitro kültür analizleri için kullanılacak olması .

8. Tümör Nakli Testi

1. Yaklaşık bir hafta önce yeni bir 15 / 0 tümör hücrelerinin toplu ve hücreler büyümeye başlar emin olun dışarı deney çözülme. Kültür orta özlü bir sonraki bölümde ve ³ daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
2. 15 / 0 tümör hücrelerinin genişletin.
3. Deney günü, hücre sayımı ve Tripan mavi dışlama hücre ölümü belirlemek. Hücre ölümü% 5'inden az olmalıdır. 4 1.000 rpm'de soğuk APBS 1X hücreleri ve santrifüj yıkayın ° C 10 dakika.
4. 300 mcL başına 5 x ⁵ 10 15 / 0 hücre yoğunluğu, tümör kültür ortamı hücreleri tekrar
5. Nakli 5 hayvanın sırt (arka) kısmı bir tarafta 25 gauge 5 / 8 iğne ile cilt altı enjeksiyonu ile kurbağa başına 300 mcL hacmi x ^{10 5} hücre .
6. Tümör büyüme tümör meydan sonra 2-3 hafta içinde başlayacak. Ilk tümör görünüm belirtti ve tümör hacmi 2-3 günde kaydedilen gereken olmalıdır. Tümör hacmi (yükseklik X uzunluk x genişlik) kaliperler kullanılarak ölçülür.
7. Tümör 3.500 mm ³ büyür ya da kurbağa uyuşuk görünümlü başladıktan sonra, bu rahatsızlığı önlemek için ötenazi gerekir.

9 - Reaktifler Gerekli:

• 6.6 g / L NaCl, 1.15 g / L Na ₂ HPO _4, 0.2 g / L KH ₂ PO: Amfibi Fosfat Tamponlu Salin (APBS). 10N NaOH ve filtre kullanılarak pH 7.5 filtre 0.2 mikron ile sterilize.
• Tricaine Metan sülfonat (TMS, MS-222) (Crescent Araştırma Kimyasallar CAS # 886-86-2).
• Sodyum bikarbonat (Fisher Scientific S-233-500).
• Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10.771-100 ml)
• Heparin Sodyum Tuz (Sigma-Aldrich H3149-50KU)
• Xenopus 15 / 0 tümörleri için kültür ortamı [3 Daha fazla bilgi için bakınız]: 10 ml İnsülin, 10 ml non-esansiyel amino asitler, 10 ml penisilin-streptomisin Iscove DMEM bazal orta 1 L (Gibco-Invitrogen 11.965); 10 mikrogram / mL Kanamisin; primatone (Sheffield Ürünleri Bölümü), β2-mercaptoethanol 1 mL ve su içinde 3.02 g NaHCO ₃ (pH 7.0) 3 ml. Bu ortam,% 30 çift distile su ekleyerek amfibi ozmolarite seyreltilmiş ve% 5 fetal sığır serumu, Xenopus böbrek hücre hattı A6% 20 superantant, ve% 0.25 'normal Xenopus serum ile desteklenebilir.

10 Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 deri grefti reddi transplantasyon sonrası 12 gün stereomicroscopic analiz. LG-6 klonlanmış kurbağa (A) aynı MHC-LG-6 ya da bir deri grefti (reddi gösterir) veya (B) birbirinden farklı MHC-outbred bir donör (80% reddi). Oklar gümüşi iridophore pigmentli hücreleri sağlıklı (non-reddedilen) aşılı doku işaretleme gösterir. (*) Mark reddi nedeniyle forsepsi.

Şekil 2. Gp96 Xenopus tümör antijenleri çapraz sunum kolaylaştırır. APBS (negatif kontrol), 1 mg, bir E. arınmış rekombinant gp96 ya da buz üzerinde 1 saat darbeli LG-15 PL (5 x ¹⁰ 5 ) Gp96 Coli kültür, ya da 1 veya 0.5 mg 15 / 0 tümör dokusu arınmış. 3 yıkar sonra, hücreler adoptively LG-15 yetişkin alıcılara transfer edildi (1 x 10 ⁶ / bireysel). Üç gün sonra, 15 / 0 tümör hücrelerinin (5 x 10 ⁵⁾ canlısc enjeksiyon yoluyla nakledilen. Her eğri bir kurbağa tümör büyüme kinetiği temsil eder. Tümörler ilk ortaya çıktıkları gün sonrası meydan monitörize edildi ve tümör boyutu, bir kaliper (uzunluk x genişlik x kalınlık) ile periyodik olarak tespit edildi.

Tartışma

Amfibi Xenopus bağışıklık çalışmak için benzersiz çok yönlü olmayan memeli modeli. Biyomedikal ve immünolojik araştırmalar yaygın kullanımı MHC tanımlanan klonlar LG-6 ve LG-15 gibi farklı hücre hatları ve monoklonal antikorlar gibi birçok önemli araştırma araçları vermiştir. Güçlü Ag-özel, küçük bir anti-H-Ag ve anti-tümör T hücre ^yanıtları 7 arabuluculuk gibi gp96 ısı şok proteinleri yeteneği çalışma in vitro ve in vivo deneylerde farklı kurduk bu araçları kullanma . Bu model sistem bize d...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gerekli Reaktifler:
Amfibi Fosfat Tamponlu Tuzlu Solüsyon (APBS):
NaCl, 1.15 g/L
Na2HPO4, 0.2 g/L
KH2PO
10N NaOH
Trikain Metan Sülfonat (TMS, MS-222)	Crescent Research Chemicals	CAS#886-86-2
Sodyum bikarbonat	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100ml
Heparin Sodyum Tuzu	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Xenopus 15/0 tümörleri için kültür ortamı [daha fazla detay için bkz. 3]:
Iscove DMEM bazal ortamı	GIBCO, by Life Technologies	11965
İnsülin
Esansiyel olmayan amino asitler
Penisilin-streptomisin
Kanamisin
Primatone	Sheffield Products Division
β2-merkapto–etanol
NaHCO3
%30 çift distile su
%5 fetal bovin serumu
%20 Xenopus böbrek hücre hattı A6 süpernatantı
%0,25 normal Xenopus serumu
Malzemeler ve Ekipmanlar:
50 ve 15 ml konik santrifüj tüpleri (steril)
25 gauge 5/8 Precision Glide steril iğneler	BD Biosciences
18 gauge 1½ Precision Glide steril iğneler	BD Biosciences
1 ml Tüberküloz Şırıngası, Slip Tip, steril	BD Biosciences
10 ml Şırınga, Slip Tip, steril	BD Biosciences
1,5 ml MikroSantrifüj tüpleri (steril)
60 X 15 mm Polistiren Petri Kapları, steril	Falcon BD
Jiletler
25 X 75 mm X 1 mm Premium Mikroskop Lamları	Fisher Scientific
10 cm cam petri kapları
9" Pasteur Pipetleri, Durex Borosilikat Cam, Pamuk Tıpalı, Tek Kullanımlık	VWR international
Tygon hortum
İki adet # 5 İsviçre Saatçi’ Penseti	Miltex Inc.
Mikro Diseksiyon Yaylı Makas, McPherson-Vannas düz kesim kenarlı 6 mm	Roboz Surgical Instruments Co.
Helios kumpaslar
Diseksiyon mikroskobu
Yüksek yoğunluklu aydınlatma
Hemositometre
Bek sempurna beki
37°C çalkalamalı inkübatör
Santrifüj