Bu protokol, canlı diseksiyonu tartışıyor. Drosophila Görüntüleme amacıyla mikrotübül parça GFP etiketli aksonal vezikül hareketi larvaları.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme
Bu makalede
Özet
Özet
Aksonal taşıma mekanizmaları nedenlerine açıklık uzun mesafe taşımacılığı hatalarına farklı nörolojik hastalıklar nasıl etkilediğini belirlemede çok önemli olduğunu göstermiştir. Bu temel süreç Hataları nöronal işleyişi ve gelişimi üzerinde zararlı etkileri olabilir. Biz, ortaya çıkarmak için tasarlanmış bir diseksiyon protokol geliştirdiler
Protokol
1. Reaktiflerin hazırlanması
- Diseksiyonu tampon hazırlama, 7.2 ve sterilize 128 mM NaCl, 1mm EGTA, 4 mM MgCl 2, 2mm KCl, 5mM Hepes ve 1000 ml, PH 36 mM Sakkaroz: Aşağıdaki bileşikleri ekleyerek hazırlayın .
2. Diseksiyon için hazırlanması
- Siligard küp jel yaklaşık bir inç genişliğinde, 1 inç uzunluğunda ve yüksekliği yaklaşık 1cm kesilir. Jel küp Diseksiyon sırasında bir bardak slayt yerleştirilir. Küpleri birden fazla kez kullanılabilir.
- Pimler: diseksiyon için kullanılan Pins kısa ekstra gerekir. Minutien pimleri keskin alt kısmında diseksiyonu en iyi çalışır.
- Bir keskin mikrodiseksiyon bahar makas ihtiyacınız var.
- Iki ince uçlu forseps ihtiyacınız var.
3. Larva, Toplanması
- 3. instar larvaları GFP etiketli vezikül proteini ifade Wandering petri üzerine toplanır.
- Larva tüm gıda kurtulmak için deiyonize su ile yıkanır.
4. Larvaların Canlı diseksiyon
- Bir larva, bir bardak slayt diseksiyonu jel küp aktarılır. Larva diseksiyonu tampon batırılır.
- Larva ön ve arka dorsal yüzü iki güzel iğne kullanarak pined.
- Mikrodiseksiyon makas kullanarak, arka sonuna yakın, orta hatta küçük bir kesi yapılır. Bu kesiden ön kesme ile yapılır. Iki iğne kullanarak, yan kenarları kesme manikür pin.
- Tampon diseksiyon bir damla ekleyin. Gut, bağırsak ve yağ organları forseps ile dikkatlice çıkartın. Bu dokuların çoğu normalde dorsal kesim sırasında sızmak.
- Taze diseksiyon tampon tampona değiştirin. Larva kuru olması asla ve sürekli tampon diseksiyon olmalıdır.
- In vivo belirteçlerinin MitoTracker veya LysoTracker kullanarak inkübatörü diseksiyonu tampon in vivo marker seyreltilmesi, şu anda yapılır. In vivo işaretleyicisinde inkübasyondan sonra disseke larva taze diseksiyon tampon kullanarak birkaç kez (5 hızlı yıkama) yıkayın.
- Değiştirdikten sonra son yıkama syligard ve hemen lamel pimleri itin. Larvaları artık gözlem için hazır.
5. Disseke larvaları Canlı görüntüleme
- Ters bir mikroskop kullanılarak mikroskop sahne ve görüntü üzerine lamel ve jel yerleştirin.
- Biz larva segmental sinirler içinde görüntü etiketli veziküller 100x bir objektif kullanın. GFP ifade ventral ganglion hücre organları segmental sinirler görüntülü önce ilk olarak değerlendirilir. Ventral ganglion hücre gövdeleri sağlam GFP boyama görülürse, sinirleri sonra görüntülü ve değerlendirme için kullanılır.
- CFP / YFP veya RFP / YFP filtreleri ve in vivo olarak biz aynı anda görüntü iki etiketli protein split görünümü yazılımı ile ikili bir görüş sistemi kullanma.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1: bir larva segmental sinir içinde birçok aksonal pistlerde birçok aksonal veziküller gösteren temsili resim aksonal birikimleri temsil eden, GFP lekeler unutmayın .
Şekil 2: bir larva segmental sinir içinde birçok aksonal veziküller ile tek bir akson parça gösteren temsili resim.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Drosophila larva segmental sinirler içinde sinaptik vezikül taşıma in vivo görüntüleme aksonal taşıma mekanizmaları çalışmak için güçlü bir araçtır. Daha önce larva sinirler içinde tekrarlar genişleme vezikül taşımacılığı 3 dinamiklerini nasıl etkilediğini aydınlatmak için genişletilmiş polyQ tekrarlar ifade taşıma dinamikleri değerlendirmek için bu protokolü kullandık. Bu protokolü kullanarak vezikül hareketinin hızı, video akışı bir kymograph dönüştürerek tespit edilebilir. Genetik kullana...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
SG, Buffalo New York Devlet Üniversitesi ve John R. Oishei Vakfı fonları tarafından desteklenmektedir.
MK UB CURCA tarafından Öğrenci Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 Çift Mikro Diseksiyon Makası | Fine Science Tools | Yaylı makas – 6mm bıçak. 0.125 mm uç çapı | |
| 2 Çift Pens | Fisher Scientific | Fisherbrand Diseksiyon Mikro-Adson tırtıklı uçlu pens | |
| Diseksiyon İğnesi Kutusu | Fine Science Tools | Minutien İğneler 0.1mm çap |
Kaynaklar
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
