Koloni oluşturan hücre (CFC) tayini hematopoetik atalarıdır yarı-katı ortamda koloniler oluşturur in vitro testtir. Koloni morfolojisi, hücre morfolojisi ve akış sitometri bir arada, farklı hematopoetik soy boyunca çoğalırlar ve ayırt atalarıdır yeteneklerini değerlendirmek için kullanılır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Koloni Oluşturan İnsan Hematopoetik Hücreler Hücre (CFC) Testi
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan hematopoietik kök / progenitör hücreleri genellikle kemik iliği, kordon kanı veya periferik kandan elde edilen ve hemopoeziste ve leukemogenesis incelemek için kullanılır. Bunlar lenfoid ve myeloid soyları ayırt etmek için kapasite var. Koloni oluşturan hücre (CFC) tayini, yarı katı bir ortamda koloniler oluşturmak için yeteneklerini proliferasyon ve farklılaşma desen hematopoetik atalarıdır çalışma kullanılır. Sabit bir sayıda giriş hücrelerinin oluşturduğu kolonilerin sayısı ve morfolojisi ayırt etmek atalarıdır yeteneği hakkında ön bilgi vermek ve çoğalırlar. Hücreler bireysel koloniler veya bütün plaka numaraları ve akım sitometri ve Giemsa lekeli dia morfolojik değerlendirme kullanarak farklılaşma devletler daha da değerlendirmek için hasat edilebilir. Bu testte, ama lenfoid değil miyeloid farklılaşma değerlendirmek için yararlıdır. Bu bağlamda vadeli miyeloid granülositik, monositik, eritroid ve megakaryocytic soy kapsayacak şekilde daha geniş anlamda kullanılır.
Biz periferik kandan elde edilen birincil insan CD34 + hücre farklılaşması onkogenler etkilerini değerlendirmek için bu testte kullandık. Bu amaçla hücreler için NUP98-HOXA9 Bu durumda, kontrol retroviral inşa veya ilgi onkogen ifade bir yapı ile transduced. Biz, ilgi ve GFP işaretleyici gen üreten bir bicistronic mRNA ifade yaygın olarak kullanılan bir retroviral vektör, MSCV IRES-GFP, istihdam etmektedir. Hücreler sitokinlerin varlığında retroviral transdüksiyon öncesinde iki gün boyunca büyüyerek önceden aktive edilir. Bir iki gün sonra, floresan ile aktive olan hücre sıralama (FACS) GFP + hücreler izole edilir ve sitokinler ile desteklenmiş ve koloniler genellikle yüzey, 14 gün kadar inkübe metilselüloz içeren yarı katı orta ile karışık. Kolonilerin sayısı ve morfolojisi belgelenmiştir. Hücreler daha sonra plakalar kaldırılır yıkanmış sayılır ve akım sitometri ve morfolojik inceleme tabi. Flow sitometri hematopoez sırasında ifade edilen hücre yüzey belirteçleri için özel antikorlar ile soy ve olgunlaşma aşamasında hakkında bilgi sağlar. Wright-Giemsa boyama sonrası mikroskop altında tek tek hücrelerin morfolojik çalışmalar, soy ve olgunlaşma ile ilgili daha fazla bilgi sağlar. Hücrelerin karşılaştırılması bir onkogen hematopoetik farklılaşma onkogen etkileri açığa transduced bu boş vektör kontrolü ile transduced.
Protokol
1. REAKTİFLERİN HAZIRLANMASI
- Fms ilgili tirozin kinaz 3 steril 1000x stok çözelti hazırlayın (FLT-3) ligand, makrofaj / granülosit koloni-interlökin (IL) -3 uyarıcı faktör (GM-CSF), kök hücre faktörü (SCF), trombopoetin (TPO), ve IL-6, üreticinin talimatlarına göre. Steril Retronectin stok solüsyonu (1mg/ml) da üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Küçük alikotları bu stok çözümleri Böl ve tekrarlanan donma-çözülme önlemek için -20 ° C'de tutmak.
- IMDM içinde% 2 FBS hazırlayın.
- % 20 FBS son konsantrasyonları, 2 mM Glutamin, 100 adet / ml Penisilin / Streptomisin (PS) ile tam IMDM orta hazırlayın. Kullanmadan önce aşağıdaki sitokinler....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
CFC tahlil hematopoetik atalarıdır çoğalmasını ve farklılaşmasını modellerini belirlemek ve onkogenler (4, 5) etkilerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu koloniler tek bir progenitör soyu temsil eden ve ileri analiz için ayrı ayrı kaldırılabilir klonal bir tahlil, sıvı kültürler üzerinde bir avantaja sahiptir. Bu tür hücreler kullanılarak tespit edilir, uzun vadeli bir kültür başlatan hücre (LTC-IC) assay (6, 7). CFC testinin sınırlama, daha olgunlaşmamış atalarıdır veya hematopoietik kök hücrelerin tes.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz flow sitometri cihazı ve sıralama hizmetleri sağlanan Yüksek Hızlı Hücre Sıralayıcısı Çekirdek, kullanmak için teşekkür Alvin J. Siteman Kanser Merkezi, Washington Üniversitesi Tıp ve St Louis, MO Barnes Yahudi Hastanesi. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık Grants R01 HL082549 ve K02 HL084179 (NRY) tarafından desteklenmiştir. Siteman Kanser Merkezi, NCI Kanser Merkezi Destek Hibe P30 CA91842 tarafından kısmen destekleniyor.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| FBS | Stem Cell Technologies | 06150 | |
| L-Glutamin | Life Technologies | 25030 | |
| Penisilin/Streptomisin (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| FLT-3 ligandı | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| Sığır Serum Albümini | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| Trypan Mavi çözeltisi (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
| İnsan Metilselüloz Zenginleştirilmiş Medyum | R&D Systems | HSC005 | |
| Wright/ Giemsa boyası | Harleco | 64571 | |
| Fosfat Tampon Çözeltisi, pH 6.4 - Giordano formülü | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| Normal Fare Serumu | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| Anti-İnsan CD11b fik–eritrin konjuge | BD Biosciences | 555388 | |
| Anti-İnsan CD33 allofikosiyanin konjuge | BD Biosciences | 551378 | |
| Anti-İnsan CD45 fik–eritrin-Cy7 konjuge | BD Biosciences | 557748 | |
| Anti-İnsan CD71 fik–eritrin konjuge | BD Biosciences | 555537 | |
| Anti-İnsan CD235a allofikosiyanin konjuge | BD Biosciences | 551336 | |
| Anti-İnsan CD45 fik–eritrin-Cy7 konjuge | BD Biosciences | 557748 | |
| 24 kuyucuklu işlem görmemiş doku kültürü plakaları | BD Biosciences | 35-1147 | |
| 30 mm işlem görmemiş kap | Stem Cell Technologies | 27150 | |
| 100 mm doku kültürü kabı | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Izgaralı skorlama kapları | Stem Cell Technologies | 27500 | |
| 15 ml santrifüj tüpleri | BD Biosciences | 35-2097 | |
| 50 ml santrifüj tüpleri | BD Biosciences | 35-2070 | |
| Şırıngalar 3 ml | Stem Cell Technologies | 28240 | |
| 16 gauge küt uçlu, 1½ inç iğne | Stem Cell Technologies | 28110 | |
| 50 μm CellTrics hücre filtresi | Partec | 04-004-2327 | |
| Hemositometre | Fisher Scientific | 0267110 | |
| TPX numune odacıkları | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| Fisherbrand Superfrost/Plus Mikroskop Lamları, Ön Temizlenmiş | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Shandon filtre kartları | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Shandon sitospin lam tutucu | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| Shandon Komple Boyama Düzenek 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| 1 μm filtre kağıdı | VWR international | 28307-134 | |
| İnverted mikroskop | Nikon Instruments | Diaphot | |
| Mikroskop kamerası | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| Mikroskop | Olympus Corporation | BX51 | |
| Mikroskop kamerası | Olympus Corporation | DP71 | |
| Tarayıcı | Microtek | Scanmaker 4 | |
| Vorteks karıştırıcı | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Doku kültürü inkübatörü | Sanyo | MCO-18AIC | |
| Sitospin | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| Masaüstü santrifüj | Eppendorf | 5810-R | |
| Su saflaştırma sistemi | Barnstead | Nanopure-Diamond |
Kaynaklar
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
