Yöntem makalesi

Hücre Kültürü sırasında Hücre Sayısını Belirleme Scepter Hücre Sayıcı

DOI:

10.3791/2204

⸱

26 Kasım 2010

 ,  ,  ,  , 
1Bioscience Division, Millipore Inc

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Scepter Hücre Sayıcı, hücre sayımı, hücre çap ve hacim izlemek ve hücresel popülasyonların sağlık ve kalite kontrol etmek için kullanılan bir kültürden diğerine kullanılabilir bir el otomatik bir cihazdır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerinin sayımı, genellikle in vitro hücre kültürü için gerekli ama sıkıcı bir adımdır. Tutarlı hücre konsantrasyonu deneysel tekrarlanabilirlik ve doğruluk sağlar. Hücre sayımı, hücre sağlığı ve proliferasyon oranı ekim sonraki deneyler, transfeksiyon veya enfeksiyon hücreleri, ölümsüzleşme ya da dönüşümün değerlendirilmesi, izlenmesi, ve hücre tabanlı deneyleri için hazırlanan için önemlidir. Hücre sayımı özellikle hücresel yanıtları kantitatif ölçümler için, doğru, tutarlı ve hızlı olması önemlidir.

Hücre sayımı, hız ve doğruluk için bu ihtiyacı olmasına rağmen, 400 araştırmacıların% 71 hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı 1 inceledi . Hemocytometry ucuz olmasına rağmen, bu zahmetli ve yanlış sayımı sonuçları kullanıcı önyargı ve yanlış kullanım, tabi. Hemocytometers hücre süspansiyonları belirtilen cilt olarak yüklenir ve mikroskop altında sayılır özel optik cam yapılır. Hemocytometry içinde hataların kaynakları şunlardır: düzensiz hücre dağılımı örnek, örnek çok fazla veya çok az sayıda hücre, belirli bir hücre belirlenen sayma alanı içinde düşüp düşmediğini olarak öznel kararlar, hemasitometre kirlenmesini, kullanıcıdan kullanıcıya varyasyon ve hemasitometre varyasyon oranı 2 doldurma.

Manuel sayma ile ilgili bezginlik hafifletmek için, araştırmacıların% 29, otomatik hücre sayım cihazları kullanarak hücre sayımı, bu vizyon tabanlı sayaçlar, Coulter prensibi kullanarak hücrelerin tespit sistemleri, ya da akış sitometri 1 . Çoğu araştırmacılar için bir otomasyon sistemi kullanılarak ana engel, bu büyük benchtop aletleri 1 ile ilişkili fiyat .

Scepter hücre sayıcı, nispeten düşük bir maliyetle otomasyon ve Coulter sayma doğruluğu sunan otomatik bir el cihazdır. Coulter, algılama için analog ve dijital donanım bir arada kullanarak minyatür bir formatta empedans tabanlı parçacık algılama 3 prensip, sinyal işleme, veri depolama ve grafik ekran kullanmaktadır . Tek ucu alt mikron ve alt pikolitrelik çözünürlük hücre büyüklüğü ve hücre hacmi ayrımcılık sağlayan bir microfabricated, hücre-algılama bölgesi ile tasarlanmıştır. Hassas sıvı taşıma kanalları ve elektronik ile geliştirilmiş, Scepter hücre sayacı grafiksel bir histogram olarak görüntülenen hücre nüfus istatistikleri raporlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre Sayım Önemi

  1. Sayma hücreleri in vitro hücre kültürü için gerekli ama sıkıcı bir adımdır.
  2. Tutarlı hücre konsantrasyonu deneysel tekrarlanabilirlik ve doğruluk sağlar.
  3. Hücre sayımı, hücre sağlığı ve proliferasyon oranı ekim sonraki deneyler, transfeksiyon veya enfeksiyon hücreleri, ölümsüzleşme ya da dönüşümün değerlendirilmesi, izlenmesi, ve hücre tabanlı deneyleri için hazırlanan için önemlidir.
  4. Rağmen, hücre sayımı, hız ve doğruluk için ihtiyacı,% 71, hemasitometre kullanarak ankete sayısı hücreleri 400 araştırmacı. Hemocytometry ucuz olmasına rağmen, bu zahmetli ve yanlış sayımı sonuçları kullanıcı önyargı ve yanlış kullanım, tabi.
  5. Hemocytometry içinde hata kaynakları şunlardır: düzensiz hücre dağılımı örnek, örnek çok fazla veya çok az sayıda hücre, belirli bir hücre belirlenen sayma alanı içinde düşüp düşmediğini olarak öznel kararlar, hemasitometre kirlenmesini, kullanıcıdan kullanıcıya varyasyon hemasitometre doldurma oranı, ve değişim.
  6. Manuel sayma ile ilgili bezginlik hafifletmek için, araştırmacıların% 29, otomatik hücre sayım cihazları kullanarak hücre sayımı. Ancak, pek çok araştırmacı, bu büyük tezgah üstü aletleri ile ilgili fiyat, bunların kullanımı için bir engel.
  7. Scepter hücre sayıcı, nispeten düşük bir maliyetle otomasyon ve Coulter sayma doğruluğu sunan otomatik bir el cihazdır.
  8. Sistemi, algılama, sinyal işleme, veri depolama ve grafik ekran, analog ve dijital donanım bir arada kullanarak bir minyatür formatında empedans tabanlı parçacık algılama Coulter prensibi kullanmaktadır.
  9. Tek sensör alt mikron ve alt pikolitrelik çözünürlük hücre büyüklüğü ve hücre hacmi ayrımcılık sağlayan bir microfabricated, hücre-algılama bölgesi ile tasarlanmıştır.
  10. Scepter hücre sayacı hassas sıvı taşıma kanalları ve elektronik ile geliştirilmiş, grafik, bir histogram olarak hücre nüfus istatistiklerinin görüntüler.

2. Sayma Tek hücreli bir Süspansiyon hazırlanması

  1. Scepter hücre sayacı kullanmak için, hücreleri tek bir hücre süspansiyonu seyreltilmesi ile başlayın, fosfat tamponlu salin. ML başına 10,000-500,000 hücre konsantrasyonu en uygunudur.
  2. 1.5 mL mikrofuge'de tüp seyreltilmiş hücrelerinin 100 mcL aktarın.

3. Hücre sayar Scepter kullanarak gerçekleştirme

  1. Scepter hücre sayıcı, cihazın arkasındaki geçiş tuşunu basılı tutarak açın ve görünmesi için ekrandaki yönergeleri bekleyin.
  2. İstendiğinde, bir sensör, cihazın önüne doğru bakan elektrot algılama paneli ile Scepter birimin sonuna kadar takın.
  3. Scepter sensörleri elektronik bir algılama bölgesi ve entegre hücre algılama elektrotlar, hassas bir kalıp örnekleme odasının oluşur. Sensörler mümkün alt mikron çözünürlüklü hücre boyutu ayırımcılık ve alt pikolitrelik çözünürlükte hücre hacmi.
  4. Tutarlı sensörü mühendislik, eşit örnek hacmi sayılır ve doğru boyutu ölçümleri yapılmış olduğunu garanti eder.
  5. Sonra sensör aşağıdaki gibi ekrandaki yönergeleri göre sayım sürecinin her adımında gerçekleştirmek eklenir:
  6. Ekranın okuduğunda "başlamak için pistonu aşağı tutarak," piston bastırın. Ekran sonra "batığın sensörü." Okuyacak Hücre süspansiyonu çözüm içine sensör ve sensör içine hücre süspansiyonu aspire pistonu serbest Batmak.
  7. Piston bir elektrik sinyali olarak görür ve örnek artı ölü hacim sensör içine çekecektir. Pipetleme gibi daldırma hızı veya doğruluğu önemli değildir. Bu işlem birkaç saniye sürer. Hazır olduğunda, cihaz bip sesi gelecektir ve "Örnek yüklü" ekranda görüntülenir.
  8. Bir kez numune sonra mikro yoluyla, hücre boyutu ve hücre hacmi değerlendirmek için algılama bölgesi üzerinden çizilmiş sensör içine yüklenir. 50 mcL örnek sayılır sonra Sensör sayımı durdurmak için araç söyler.
  9. Sayımı tamamlandıktan sonra, cihazın ekranında "Komple Kont. Sensörünü çıkarın ve atın lütfen." Okuyacak Istemi izleyin ve sensörünü çıkarın ve atın.
  10. Cihaz, daha sonra, hücre boyutu veya çapı, ekranda bir histogram yanı sıra mL başına hücre konsantrasyonu gösterecektir.

4. Veri Analizi

  1. Sayımı tamamlandı ve histogram enstrüman görüntülendikten sonra, düğmeyi basarak kapıları geçerlidir. "Otomatik yolluk" veya histogram profiline göre otomatik olarak kapı ya da "son kullanma" ya da önceki sayısı kapılarını kullanmak için seçin.
  2. Seçimin ne olursa olsun, kapıları elle ince ayar verileri taşınmış olabilir. Sol kapı seçin ve kaydırma tekrar düğmeyi itin, istediğiniz gibi kapı hareket etmek ggle.
  3. Sonra sağ kapı etkinleştirmek ve sağ kapı yere geçiş ilerlemek için tekrar geçiş tuşuna basın. Tekrar tıklayın, yeni bir hücre konsantrasyonu, ortalama hücre hacmi ve çapı görünecektir.
  4. Geçiş tarihi arasındaki ekran geçmek için iki tarafa taşınmış olabilir, süre, ortalama hücre boyutunu ve ortalama hücre hacim.
  5. Cihazın kendisi 72 histogramlar kadar saklanabilir. Bir kişisel bilgisayara veri yüklemek için, ekran, USB kablosu portu üzerinden cihaz takın.
  6. PC üzerinde, çift "connect" tıklayın sonra yazılımı başlatmak için Scepter Yazılım Uygulaması tıklayın. Tüm sayıları otomatik yazılım bağlantı noktası olacaktır.
  7. Scepter Uygulama Yazılımı hacmi veya çapı iki kültürün nüfus dağılımı ayrıntılı histogram görüntüler. İndirilen dosya daha sonra, ham veriler, belirli bir hücre çapları veya hücre hacimleri bidonları gözükecektir Microsoft Excel, ihraç edilebilir.

5. Temsilcisi Sonuçlar

  1. Ondokuz farklı hücre hatları sayma hazırlanmış ve teorik başlangıç ​​konsantrasyonları bir Coulter Sayaç kullanılarak belirlenmiştir. Bu hücre süspansiyonları daha sonra teorik hücre konsantrasyonları hücre süspansiyonları elde seyreltilir.
  2. Scepter hücre sayacı sonra hücre konsantrasyonlarını belirlemek için kullanılmıştır. Şekil 1, 5, teorik olarak hücre konsantrasyonu ile birlikte 5 temsilci hücre hatları için ölçüldü dilüsyonları gösterir.
  3. R2 değerleri ile gösterilir doğrusallık yüksek derecede, Scepter sayma, geniş bir doğrusal çalışma aralığında, test edilen hücre hatları için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermektedir.
  4. Scepter sayma genel göreceli doğruluğu, Coulter Sayma elde sayıları ile karşılaştırıldığında hangi Scepter sayma elde edilen veriler Şekil 2'de gösterilmiştir.
  5. Scepter hücre sayıları günlük, günlük Coulter sayar karşı çizilen ve tüm hücre hatları üzerinden test, Scepter sayıları Coulter sayar maç gösterir.
  6. 19 hücre hatları sayar Z2 Coulter Sayaç, Scepter hücre sayacı, Vi-Cell ya da sayısız sistem otomatik olarak görüntü tabanlı sayaç, ve bir hemocytemeter kullanılarak yapıldı.
  7. Sayımlar, aynı hücre süspansiyonu ve aynı dilüsyonları başlayan kullanarak, üreticinin talimatlarına göre yapılmıştır. Şekil 3'te gösterilen sonuçlar, söz konusu hücre konsantrasyonları yüksek doğrusallık teorik hücre konsantrasyonları yakından maç Scepter sayarak ölçülen göstermektedir.
  8. Yüzde değişim katsayısı, ya da CV, her sayım sistemi için her bir hücre hattı her seyreltme için hesaplandı. Şekil 4 hücre konsantrasyonu ve sayım yöntemi ile ilgili 19 hücre hatları üzerinden ortalama% özgeçmişleri gösterir.
  9. Çalışma aralığı içinde, Scepter hücre sayacı, küçük bir standart sapma ve varyasyon küçük ortalama katsayılar, vizyon temelli hemasitometre sayma daha hassas.
  10. Scepter sayma hemocytometry on kat daha hızlı ve daha hızlı çok diğer otomatik sayaçlar. Şekil 5, SF9, MCF7 ve HEK293 hücreleri bu video açıklanan yöntemleri kullanarak sayıldı.
  11. Hücre konsantrasyonunu ölçmek için gerekli ortalama süre kaydedildi. Hemocytometry örnek başına sadece bir kez yapıldı.
  12. Scepter hücre boyutu dayalı ölçümler yapar. Böylece hücresel morfoloji herhangi bir değişiklik histogram yakalanabilir. Sağlıklı kültürleri, sağlıksız hücreleri, lyse ve sola doğru bir kayma histogram (Şekil 6, sol panel) neden güzel bir çan şeklindeki Gauss dağılımı gösterir.
  13. Benzer şekilde,% 50 ölü hücreleri nüfusunun% 50 canlı hücreleri ile karışık olduğu, histogram vardiya de (Şekil 6, sağ panel) gözlenmiştir.

figure-protocol-1

figure-protocol-2

figure-protocol-3

figure-protocol-4

figure-protocol-5

figure-protocol-6

figure-protocol-7

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Scepter hücre sayıcı performans, diğer sayım yöntemleri sonuçları karşılaştırıldığında, bu yeni el, otomatik hücre sayıcı geniş bir çalışma aralığı boyunca hassas, hızlı ve güvenilir hücre sayımı sunar sonucuna varmışlardır. Scepter sayma işlevselliği sensör ucu ve Coulter ilkesine dayalı karmaşık sayım enstrümantasyon içine gömülü hassas mühendislik teknolojisinin bir sonucu. Performans kalitesi, hızını artırmak ve hücre tabanlı testlerin tekrarlanabilirliği geliştirmek için bir yöntem olarak sayma Scepter göstermektedir. El formatı hücre kültürü kaputu hızlı bezginlik sayma hakkı sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Kathleen Ongena, Chandreyee Das, Janet L. Smith, Sonia Gil ve Grace Johnston, bu yazıda kullanılan aletleri üreten Millipore tarafından istihdam edilmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzeme Adı Şirket Katalog Numarası Yorum
40 mikron Scepter Sensörler Scepter 2.0 Taşınabilir Otomatik Hücre Sayıcı EMD Millipore PHCC20040
60 mikron Scepter Sensörler Scepter 2.0 Taşınabilir Otomatik Hücre Sayıcı EMD Millipore PHCC20060
Scepter Sensörler, 60 mikron EMD Millipore PHCC60050 50 Pack sensörler
Scepter Sensörler, 40 mikron EMD Millipore PHCC40050 50 Pack sensörler
Universal Güç Adaptörü EMD Millipore PHCCPOWER
Scepter O-Ring Seti EMD Millipore PHCCOCLIP 2 O-ring ve bir filtre kapak

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barghshoon, S. Cell Counting Survey. , Millipore. (2009).
  2. Tucker, K. G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C. R. Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis. Enzyme Microb Technol. 16 (1), 29-35 (1994).
  3. Houwen, B. Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle. , Medical Laboratory Observer. (2003).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre Say mCoulter PrensibiOtomatik H cre SayacEl CihazH cre KonsantrasyonuH cre Boyutu AnaliziHistogram G sterimiEmpedans Alg lamaH cre Canl l

İlgili makaleler