Basma, bitki ve memeli üreme bir olgudur. DNA metilasyon, imprinting mekanizmaları önemli bir rol oynar. Endosperm Yalıtımlı ve baskılı genlerinin metilasyon durumunun belirlenmesinde Arabidopsis Zor olabilir. Bu protokol, endosperm izole ve metilasyon bisülfit sıralama tarafından nasıl belirleneceği açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm
Bu makalede
Özet
Özet
Arabidopsis thaliana epigenetik mekanizmalar çalışmak için mükemmel bir model organizmadır. Nedenlerinden biri DNA methyltransferases kaybı fonksiyon-boş mutant böylece bir genom DNA metilasyon kaybı, büyüme ve gelişme nasıl etkilediğini incelemek için bir sistem sağlayarak, yaşayabilir. Basma maternal ve paternal allellerin diferansiyel ifadesi anlamına gelir ve hem de memeli hayvan ve bitkilerin üreme gelişmesinde önemli bir rol oynar. DNA metilasyon baskılı bir gen anne veya baba allel ifade ya da susturulmuş olup olmadığını belirlemek için kritik öneme sahiptir. Çiçekli bitkiler, bir çift üreme döllenme olayı var: tek bir sperm hücresi yumurta hücresi embriyo ve endosperm yol vermek için merkezi bir hücre ile ikinci bir sperm sigortalar oluşturmak için döller. Endospermi imprinting, bitkilerde meydana gelen bir dokudur. MEDEA, bir SET etki Polycomb grup gen, FWA, çiçekli düzenleyen bir transkripsiyon faktörü, endosperm ve kendi ifade baskılı gösterilen ilk iki gen, DNA metilasyon ve demetilasyon tarafından kontrol edilir bitkiler. Bir gen ve endosperm metilasyon paterni imprinting durumunu belirlemek amacıyla, ilk endosperm izole etmek gerekir. Tohum Arabidopsis ufak olduğundan, Arabidopsis endosperm izole ve metilasyon incelemek için zorlu kalır. Bu video protokolde, tohumları endosperm doku izole etmek için, genetik bir çapraz yapmak ve bisülfit sıralama metilasyon durumunu belirlemek için nasıl rapor.
Protokol
I. Genetik Crossing
1. Kadın ebeveyn Emasculating
DNA dizisi polimorfizm, iki farklı ekotipler, örneğin Columbia-0 (Col-0) ve Ler, kadın ve erkek ebeveynler olarak seçilecektir ile anne ve baba allel ayırmak için. Bitkiler genç ve sağlıklı olmalıdır. Bir büyüteç visor, ya da çıplak gözle, bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak dişi ebeveyn hadım. Evre-12 çiçek bulun (Smyth ve ark, 1990) ve makas ile sapçık temel kırpma herhangi bir çiçek veya siliques yukarıda ve aşağıda onları çıkarın . Forseps% 95 etanol forseps üzerinde herhangi bir polen taneleri kaldırmak ve aynı zamanda polen öldürecek bir beher, içine hafifçe ucunun taban batırarak sterilize edin. Yavaşça forseps kullanarak çiçek tomurcukları dışında gözetlemek ve yavaşça dişilik organı çıplak ve zedelemeden, 4 sepals, 4 yaprakları, 6 organlarındaki kaldırmak. Bu işlem sırasında carpels zarar görmesini önlemek için deneyin.
2. Polen donör Toplama ve tozlaşma yürüten
Iyi polen donörlerin polen bir çok dökülme olduğu dişilik organı (Smyth ve ark, 1990), 90 ° açıyla uzanan yaprakları ile 14 sahne açık çiçek anthesed. Üssünde çiçek alın ve sapçık hemen üstünde, çiçek açık yayılmasına sebep olacaktır. Anter ile hazırlanan dişilik organı stigma Toz. Tozlaşma sonra, bir mikroskop altında kolayca görülebilir sarı polen, damgalanma ile kaplı olacaktır.
3. Çapraz Etiketleme
Bir bitkinin tüm hadım pistils pollinating sonra, biz bir mücevher etiketi ve dişi ve erkek ebeveynler ve güncel bilgi ile çapraz etiket. Toprak bitki yakın bir hissesi yerleştirin, bir dize, kazığa gelişme kök bağlamak için kullanın ve plastik bir çanta ile tozlaşma pistils kapağı.
II. Arabidopsis endosperm Dokular izolasyonu
1. Hazırlanması malzemeleri
: Biz genellikle bir sıvı nitrojen tankı, sıvı azot, bir diseksiyon mikroskobu ucu ince forseps (Dumont biyoloji tarafından 5 INOX FST, İsviçre), mikroskop cam slaytlar iki yeni çift (endosperm ve embriyo dokuları hasat öncesi gerekli malzemeler hazır 3 "X 1" X 1.0 mm), sorbitol 0.3 M pH 5.7 çözümü ve 5 mM (MES).
2. Toplama siliques
7 - veya 8-gün sonra-tozlaşma (DAP), tohum, orta ve geç torpido sahne embriyogenez hasat ve endosperm ve embriyo için disseke hazırız. Bazen hadım çiçekler çok genç, 9-10 DAP sürebilir.
3. Yalıtımlı endosperm ve embriyo
Arabidopsis tohumu küçük olduğundan, endosperm ve embriyo izole etmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. 8-DAP silique bir mikroskop altında bir koyun, silique sapçık tutmak için forseps, bir çift ve iki carpels sigorta marjı açık silique slayt forseps başka bir çift ucu kullanın. PH 5.7 sorbitol 0.3 M ve 5 mM MES çözümler üzerine bir tohum almak için forseps bir çift kullanın, embriyo slayt micropyle sonunda küçük bir kesim yapmak, endosperm ve tohum kabuğu ayrı endosperm dışarı itmek için kesilmemiş sonuna sıkmak (Kinoshita ve ark, 2004). Embriyo ve endosperm sıvı nitrojen içinde ayrı mikrotüpler içine koyun. 10-15 siliques embriyo ya da endosperm birikir kadar bu devam edin ve sonra tüp -80 ° C derin dondurucuda saklayın. Bazı durumlarda, endosperm, tohum kabuğu, yani ayrılmış olması değil, tek bir gen imprinting analizi için endosperm ve tohum kabuğu karışımı total RNA izole.
III. Bisülfit Sıralama
1. Gerekli reaktifleri
Genomik DNA, restriksiyon enzimleri, 3 M NaOH (Taze yapılmış), 6,42 M üre / 4 M sodyum bisülfit (190 2 M sodyum metabisülfit, Sigma-Aldrich, S9000, Na2S2O5, Moleküler Ağırlık) hazırlamak için Cetyltrimethyl amonyum bromür (STAB) 10 mM hidrokinon, bir DNA temizleme kiti (Promega Sihirbazı DNA Temizlik Sistemi, Kedi # A7280), TE tampon, 6.3 M NaOH (taze yapılmış), 10 M NH 4 oac, 20 mikrogram / mcL tRNA ve% 100 etanol .
2. Bisülfit tedavi protokolü Detayları
- Genomik endosperm veya CTAB yordamı kullanarak embriyonun DNA (Rogers ve Bendich, 1988) kesin.
- Digest 100 ng - 20 mcL 100 mcL toplam hacmi analiz edilecek bölge dışından kesen restriksiyon enzimleri ile genomik DNA 2 mg. MEA organizatörü için, biz XhoI, NdeI ve PstI veya HindIII kullanın.
- DNA beş dakika kaynatarak restriksiyon enzimlerinin denatüre ve ardından buz üzerinde gidermek.
- 15 dakika boyunca 37 1 / 9, 3 M NaOH ve inkübe hacmi (20 mcL sindirilir DNA 2.2 mcL) ° C ekleyin.
- 250 mcL PCR tüp çözüm aktarın.
- 10 ml steril distile su, 7.5 g üre çözülür; yavaş yavaş ekleyin ve 1-2 saat içinde 7.6 g sodyum metabisülfit ısıtma genellikle erime yardımcı olur; pH 5 ile 10 M NaOH taze yapılmış ayarlayın; bir final steril distile su ekleyin 20 ml hacim. Bu 6.24 M üre / 4 M sodyum bisülfit çözüm.
- Sırasıyla 6.24 M üre son konsantrasyonu 5.36 M / 4 M sodyum bisülfit çözüm ve 3.44 M (Paulin ve ark, 1998). Örneğin, 6,42 M üre / denatüre genomik DNA (Xiao ve ark, 2003) Yukarıdaki 22.2 mcL 4 M sodyum bisülfit çözümü 208 mcL ekleyin.
- 0.5 mM (20 mcL sindirim için 12 mcL) son bir konsantrasyonda DNA 10 mM hidrokinon ekleyin.
- 55 ° C de 15 dakika ve 95 ° C 'de 30 saniye için 30 kür: PCR makinesi bisülfit tedavi yapılması
- Promega Wizard DNA Temizlik-Up Sistemi kullanılarak bisülfit tedavi DNA Desalt ve protokolü takip (Jacobsen ve ark, 2000).
- TE tuzsuzlaştırma sonra sütun kurtarıldı tam hacmi ölçün ve 37 0.3 M. inkübe son konsantrasyonu 6.3 M NaOH eklemek ° C 15 dakika boyunca.
- 3 M nihai bir konsantrasyon, 2 mcL 20 mikrogram / mcL tRNA ve 3 hacim% 100 etanol ile 10 M NH 4 oac (pH 7.0) ekleyin ve karıştırın. 14.000 rpm'de 15 dakika santrifüj.
- Bir kez,% 70 etanol ile pelet yıkayın kısa bir santrifüj yapmak ve ekstra etanol çıkarın.
- 5-10 dakika ve 25 tekrar süspansiyon için speedvac Kuru pelet - DNA miktarı başlangıç bağlı olarak 100 mcL TE tampon. Sodyum bisülfit ile tedavi edilen DNA PCR analizi için hazırdır.
3. PCR
- Unmethylated cytosines urasil dönüştürülmüş olduğundan, bu büyük bir parçası, bir şablon olarak bisülfit ile tedavi edilen DNA kullanarak yükseltmek için zordur. Böylece, genellikle bir ürün artık 500 bp daha yükseltmek için primerler dizayn. 4-kb MEA organizatörü dizisi için astar birçok setleri tasarlanmış ve tüm bölgeyi kapsayacak şekilde 14 örtüşen parçaları amplifiye (Xiao ve ark, 2003).
- Üst iplikçik dizisi için ileriye astar, I) tasarımında primerleri ekstra uzun nükleotidler olmadan daha yüksek bir tavlama sıcaklığı için G (guanin) açısından zengin bir bölge seçin; II) değişiklik C (Sitozin) Y ( CG ve CNG bağlamlarda pirimidin) ve T (Timin) kalan C değiştirin. Ters astar, I) tasarımı C-zengin bir bölge seçin; II), CG ve CNG bağlamlarda R (pürin) G değiştirmek ve kalan G A (adenin) değiştirin.
- CG ve CNG bağlamlarda R G değişikliği ve seçim ters astar, I) tasarımı A. kalan G değiştirmek II); alt sırasına iplikli, ileriye astar, I) tasarımı C-zengin bir bölge seçin G-zengin bir bölge; II) Y (pirimidin), CG ve CNG bağlamlarda C değiştirmek ve T. kalan C değiştirmek
- Biz genellikle her PCR (Xiao ve ark, 2003) için bir şablon olarak sodyum bisülfit ile tedavi edilen DNA 1-2 mcL kullanın. PCR ürünü Parçanın doğru boyutu onaylamak için sonra bir ekleme olarak jel saflaştırılmış ve TOPO TA klonlama vektörü pCR2.1 (Invitrogen) klonlanmış olması, jel elektroforezi ile analiz edilmesi gerekiyor. Tek bir koloni aldım ve kültür; plazmid DNA ayıklanır ve sıralama için gönderilir.
4. Sekans analizi
Bisülfit sıralama ilkesi unmethylated sitozin PCR ürünü timin olarak yükseltilecek pH5.0 yüksek konsantrasyonda sodyum bisülfit hidrolitik deaminasyon nedeniyle urasil dönüştürülür olacak, 5-metil sitozin sodyum bisülfit tarafından güncellenmiştir izin vermeyecek ve PCR (. Frommer ve ark, 1992. Clark ve ark, 1994) sonra sitozin kalır. Sıralama sonucu elde ettikten sonra, PCR için kullanılan iplikçik belirli bir şablon ile karşılaştırın. Şablonu bir sıralama sonucu bir timin sitozin kalıntı olarak okursa, sitozin metil olmadığını gösterir. Şablonda bir sitozin kalıntı sıralama bir sitozin kalırsa, sitozin metil olduğu anlamına gelir.
IV. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Embriyo, endosperm ve tohum kabuğu ayırmak için nispeten kolaydır, ancak embriyogenez erken veya orta-torpido aşamada özellikle tohum tohum kabuğu, endosperm ayrı sıkıcı. Tohum kabuğu, sadece bazı genler için çok küçük bir miktar doku katkıda bulunmasından dolayı, örneğin, MEA ve FWA, endosperm, tohum kabuğu ayırmak zorunda değilsiniz. Endosperm ve tohum kat dokularda oluşan bir karışım RNA'lar tecrit anlamına gelir ki, bir genin anne ve baba allel ifade, embriyo ifade ile karşılaştırın ve genin im...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Yazarlar Arabidopsis bitkilerin bakımı için Bayan Jennifer M. Lommel ve Tara N. Rognan teşekkür ederim. Bu çalışma, Saint Louis Üniversitesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık hibe 1R15GM086846-01 ve 3R15GM086846-01S1 W. Xiao başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Sarf Malzemeleri
- Diseksiyon Mikroskop
- Makas
- İnce İpucu Forseps
- Takı Etiketi
- Bitki Stakes
- String veya Döndür-Kravatlar
- 4 "X 2" X 8 "Polietilen Çanta
- 3 "X 1 X 1,0 mm Mikroskop Slaytlar
- Sıvı Azot
- Sıvı Azot Konteynerler
- Isı Blok
- PCR Tüpleri
- PCR
- Mikrosantrifüj Tüpler
- Mikrosantrifüj
- Jel Elektroforez tesisi
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Tesisleri
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta'nın Tesisleri
Reaktifler
- % 70 Etanol
- % 95 Etanol
- % 100 Etanol
- Sorbitol 0,3 M ve 5 mM MES-pH 5.7
- Cetyltrimethyl Amonyum Bromür (STAB)
- % 100 Etanol
- Cholorform
- Kısıtlama Enzimler
- 3 M NaOH
- 6.3 m NaOH
- 6,24 M Üre / 4 M sodyum bisülfit
- Steril distile H 2 O
- 10 mM hidrokinon
- Sihirbazı DNA Temizlik Sistemi (Promega)
- 10 M NH 4 oac
- 20 mikrogram / mcL tRNA
- TE tampon
- TOPO TA Klonlama Kiti (Invitrogen)
Kaynaklar
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. Nature. 452, 215-219 (2008).
- Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).
- Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. Cell. 124, 495-506 (2006).
- Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. Accurate sodium bisulfite sequencing in plants. Epigenetics. 5, 47-49 (2010).
- Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm. Science. 324, 1451-1454 (2009).
- Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis. Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).
- Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Science. 303, 521-523 (2004).
- Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
- Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462, 315-322 (2009).
- Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA. Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).
- Rogers, S. O., &, B. endich, J, A. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. Early Flower Development in Arabídopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase. Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
