İntraperitoneal Enfeksiyon sonra Bağışıklık Hücreleri Ticareti Floresan Prion Çubuklar Saat İzlenmesi

Özet

Burada hemen arındırıcı intraperitoneal aşılama ve floresan sonra enjeksiyon yerinde alımı ve hareket izleme ve bu olaylara aracılık eden hücreler karakterize enfekte beyin malzeme toplanan prion çubuklar etiketleme prion alımı ve ticareti bağışıklık hücreleri tarafından izlenmesi için yeni bir tahlil açıklar.

Özet

Anormal bir formu varlığı, proteaz, dayanıklı, patolojik ve bulaşıcı bir host-kodlanmış prion proteini (PrPC) Kronik Wasting koyun cervids ve scrapie hastalığı (CWD) olarak prion hastalıkları karakterize etmektedir. Prion hipotez bu anormal conformer çoğu veya tüm bulaşıcı prion teşkil ettiğini ileri sürmektedir. Periferik prion patogenezinde erken olaylar bağışıklık sisteminin rolü ikna edici CWD ve scrapie ^1-3 kanıtlanmıştır. Farelerde Transgenik ve farmakolojik çalışmalar sonrası erken dönemde enfeksiyon ^4-6 prionlar istinat ve kopyalayan Kompleman sisteminin önemli bir rolü ortaya koymuştur. ^7-10 dendritik hücreler tarafından prion tutma gözlemledik in vitro ve in vivo çalışmalar, insan ticareti rollerini olmaya devam etmekle beraber, ^11-16 belirsiz. Makrofajlar benzer erken prion patogenezinde suçlanmıştır, ancak bu çalışmalar, ^enfeksiyon 3,11,17 hafta sonra meydana gelen olaylar üzerine odaklanmıştır . Bu ve önceki çalışmalarda da endojen PrP ^C ve bulaşıcı prionlar arasındaki farklılıklarda sorun muzdarip. İşte biz orada alınan bağışıklık hücreleri tarafından aşılama sitesinden prion alımı ve ticareti değerlendirmek için bir semikantitatif, tarafsız bir yaklaşım açıklar. Toplulaştırılmış prion çubuklar olmayan toplanan proteinleri ve sakaroz yastık üzerinden Ultrasantrifügasyon deterjan çözünürleştirme ile enfekte beyin Homojenat arınmış. Poliakrilamid jel elektroforezi, Coomassie mavi boyama ve zenginleştirilmiş pelet fraksiyonu prion çubuklar batı blotting teyit kurtarma. Prion çubuklar farelere florokrom-etiketli enjekte intraperitoneal. İki saat sonra, peritoneal lavaj sıvısı, dalak ve mediastinal ve mezenterik lenf düğümleri bağışıklık hücreleri prion çubuk tutma ve monositler, nötrofil, dendritik hücreler, makrofajlar ve B ve T hücreleri için işaretleri kullanarak çok renkli akım sitometri ile tespit edilen hücre alt grupları ölçüldü. Bu testte, enfeksiyondan sonra saat içinde bağışıklık elde hücreleri ve in vivo kaçakçılığı prionlar ilk kez doğrudan izleme sağlar . Bu testte de zor ve diğer test sistemlerinde veri yorumlama sorunları neden olabilir normalde ana hücreleri üzerinde ifade PrPC bulaşıcı, toplu prion, açıkça ayırır. Bu protokol, diğer aşılama yolları (oral, intravenöz, intranervous ve derialtı, örneğin) ve aynı zamanda antijenler (konjuge boncuk, viral, bakteriyel ve paraziter patojenler ve proteinler, yumurta) adapte edilebilir.

Protokol

1. Prion Çubuklar Arındırıcı ve Etiketleme

Bu protokol daha önce yayınlanmış ¹⁸ uyarlanmıştır

1. Ticari bir blender maksimum hızda 1 dakika, 2 dakika sonra buz üzerinde buz gibi homojenleştirici tampon 900 mL prion ile enfekte beyin dokusu 100 gram (HB, 320 mM sakkaroz, 150 mM NaCl ve 4mm EDTA içeren 1X PBS) karıştırılır. Üç kez tekrarlayın.
2. 3000 xg'de 10 dakika ve 4 ° C Homojenat Santrifüj Çıkarın ve buz üzerinde supernatant kaydetmek. 1L HB pelet yeniden askıya alma ve 1.1 ve 1.2 adımları tekrarlayın.
3. 100.000 xg, 0 ° C 60 dakika Havuzu süpernatantlar ve santrifüj Süpernatant atın.
4. Yeniden askıya 100 ml 1X Tris pelet tamponlu tuz (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM NaCl ve 1 mM EDTA) içeren% 2 Triton X-100 (TBST). Tahmin Bradford veya benzer tahlil protein konsantrasyonu ve 5 mg / ml TBST ayarlayabilirsiniz. 30 dakika buz üzerinde soğutun.
5. 100.000 xg, 0 ° C 30 dakika santrifüj Süpernatant atın ve 50 ml TBST sonra 100 mL TBS ile yıkayın pelet. 100 ml 1X PBS% 1 sarcosyl ve proteaz inhibitörü kokteyl içeren pelet Re-37 az 120 dakika süreyle askıya alma ve heyecan ° C.
6. 100.000 xg, 10 ° C, 60 dakika için 320 mM sukroz ve santrifüj 900 mL Katman örnek Süpernatant atın ve 10 ml 2,3 M NaCl içinde yeniden askıya pelet,% 5 sarcosyl.
7. Örnek 5 x 40 saniye, 1 dakika aralıklarla buz üzerinde% 70 maksimum güç sonikasyon.
8. 13.000 xg, 4oC az on beş dakika için Eppendorf tüpleri ve santrifüj içine örnek kısım 1 ml. TBS ve mağaza ile iki kez yıkayın pelet @ -70 ° C veya adım 1.9 florokrom ile konjuge.
9. Prion çubuklar kullanarak DyLight 649 1 şişe saf Konjugat 1 tüp, üretici firmanın protokolüne göre florokrom.
10. PBS için filtre sütunları ile diyaliz veya santrifüj Exchange DyLight etiketleme tampon. -70 ° C kullanıma hazır olana kadar uzakta ışıktan 20 mcL alikotları saklayın.

2. Prion Aşılama ve Hücre Kurtarma

Bu bölümde, intraperitoneal prion aşılama ve periton, mediastinal ve mezenterik lenf düğümleri ve dalak hücreleri kurtarma kapsar.

1. Kullanımdan hemen önce floresan prion çubuklar PBS ile 1:50 sulandırınız. Başparmak ve işaret parmağı ile dorsal boyun kürk ense fare, hafifçe yüz ve serçe parmak ile kuyruk dizginlemek için fare açmak. Başının üstünde arka gövde yükselten ve onu biraz baş aşağı tutarak, fare Supinate.
2. 30G insülin şırınga kullanarak, sakroiliak eklem anterior orta hat ve 1-2 cm 1 cm lateral floresan prion çubuklar 100 mcL enjekte edilir. 1 cm deri yoluyla mediale 45 ° yönetti iğne takın. Kontrol grubu olarak floresan bilyeler veya PBS tek başına 1:50 seyreltme kullanın. Analizden önce ayrılan zaman fareler inkübe edin.
3. Onaylanmış hayvan bakımı göre fareler Euthanize ve komite protokollerini kullanmak. PBS 10 ml, 12 ml şırınga ve 25G iğne kullanarak periton boşluğuna enjekte edilir. Bir dakika boyunca hafifçe boyuna karkas sallayın. Karkas diseksiyonu devam ederken, buz üzerinde, 15 ml konik tüp ve yedek aynı şırınga ve 16G iğne kullanarak periton hücre süspansiyonu kurtarın.
4. Karkas ventral tarafında% 70 etanol ile iyice ıslatın. Sadece forseps ile göğüs kafesi altındaki orta hat cilt kaldırın ve makas ile deri yoluyla küçük bir kesi kesmek. Her iki ucunda iki orta hatta 2 cm kesiler yanal, daha sonra baş ve kuyruk her iki yönde de deri yoluyla 3-5 cm uzunluğunda bir kesi yapmak, orada başlayarak. Geri Peel ve peritoneal ve torasik boşlukları ortaya çıkarmak için cildi pin. Dikkatle periton çevreleyen ince saydam membranlar kesti ve mediastende ortaya çıkarmak için toraks yansıtacak.
5. Trakea ventral kenarında brakiyosefalik arterin medial bitişik timus biraz dorsal ve yanal bitişik 2-4 mediastinal lenf düğümleri,, bulun ve çıkarın. Bulun ve yumuşak beyaz mezenterik dokusunda gömülü altı mezenterik lenf düğümleri, yukarı kaldırmak posterior abdominal duvar çapa bağırsak. Dalak, sadece orta hat ve lateral dorsal karnın sol tarafında bağırsaklarında bulunan uzun, koyu kırmızı organ bulun ve çıkarın. Rezerv lenf düğümleri 1 ml RPMI 1640 orta buz üzerinde diseksiyon tamamlanana kadar.
6. 1 ml şırınganın pistonu kullanarak bir plastik Petri kabındaki RPMI 3 mL 40 mikron mesh süzgeç ile ıslatarak yumuşatmak ve lenf düğümleri basın. RPMI ek bir 2 mL süzgeç durulayın ve 15 ml konik bir tüpe 5 ml hücre süspansiyonu transfer. Petri kabı RPMI ek bir 5 ml ile durulayın ve aynı tüp transferi. 250 xg'de 5 dakika santrifüj, 1 ml FACS tampon (1X PBS,% 1 sığır serum albumin ve 10 mM EDTA) supernatant, yeniden askıya hücre pelletini atmak ve 1.5 ml Eppendorf tüp transferi.

ove_title "> 3 Hücre Boyama ve Sitometrisi

Iyi karakterize bağışıklık hücre yüzey belirteçleri karşı floresan antikor kullanarak bağışıklık hücre alt grupları tanımlamak için aşağıdaki tipik bir boyama protokoldür. Tüm antikorlar kullanmadan önce hemen FACS tampon içine seyreltilmiş.

1. Eppendorf tüpleri içine hücreleri ve kısım 10 ⁶ hücre güvenin. Santrifüj hücreleri (2.7) ve 1 ml FACS tamponu ile yıkama pelet 2X.
2. Endojen Fc reseptörlerini bloke 2 ng / ml sıçan anti-fare CD16/32 100 mcL hücreleri buz üzerinde 20 dk inkübe edin. Pelet ve FACS tamponu ile yıkama hücreleri.
3. Bir saat boyunca her bir örnek ve buz üzerinde inkübe 1ng / ml uygun floresan antikorlarının (y) ler 100 mcL ekleyin. Kontrol hücreleri tek başına FACS tampon 100 mcL ekleyin. Pelet ve iki kez yıkayın hücreleri FACS tampon.
4. 1 ml ACK tamponu (NH ₄ Cl 150 mM, 1 mM KHCO ₃ ve 0.1 mM EDTA), kırmızı kan hücreleri lyse için 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri yeniden askıya . Pelet ve FACS tamponu ile yıkama hücreleri. 1 ml FACS tampon hücreleri yeniden askıya.
5. Genellikle 405, 488 ve 633 nm eksitasyon lazerler ve 09:55 floresans emisyon dedektörleri, çok renkli algılama ve analiz yeteneğine sahip bir akış sitometresinin kullanarak hücrelerin veri toplama.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Biz ham prion çubuklar saflaştırılmış, E2 geyik beyin Homojenat (hat 1 ve 2) prion ile enfekte beyin Homojenat (Şekil 1) Deterjan çözünürleştirme ve Ultrasantrifügasyon proteaz K prion çubuklar (1 ve 3 şeritli karşılaştırmak), büyük ölçüde zenginleştirilmiş dirençli (4 şeritli). İlginçtir ki, sindirilmemiş saflaştırılmış prion çubuklar prionlar için dramatik zenginleştirme gösteren çarpıcı bir şekilde sindirilir E2 beyin Homojenat benzer bir glycoform profili görüntülenir. Aynı tedavi normal beyin Homojenat hiçbir PK-dirençli PrP ^C (şerit 5 ve 6) üretti.

Belirli hücre popülasyonlarının Flow sitometrik analizi antijen iki saat periton hücreleri ev sunulması ve floresan boncuk ve prion çubuklar, PBS enjekte kontroller üzerinde dramatik bir artış floresan (Şekil 2) ile kanıtlandığı gibi korumak göstermektedir. Boncuk (Şekil 2H-N) hücreleri ve prion (Şekil 2O-U) inokule önemli floresan görüntülenir fareler ise, arka plan yukarıda floresan (Şekil 2A-G) görüntülenen PBS tedavi kontrolleri periton hasat hücre yok, özellikle monositler (Şekil 2I ve P), dendritik hücreler (Şekil 2K ve R) ve makrofajlar (Şekil 2L ve S) ve bazı Nötrofiller (Şekil 2J ve Q) ve daha az B hücreleri (Şekil 2T). Boncuk ve Prion taşıyan monositler, dendritik hücreler ve makrofajlar da mediastinal lenf düğümleri aşılama (Şekil 2AD ve AK, AF ve AM ve AG ve AN, sırasıyla) ise az ya da hiç PrP ^CWD taşıyan Nötrofiller iki saat sonra bulundu , B veya T hücreleri (Şekil 2AE ve AL, AH ve AG ve sırasıyla AI ve AP) tespit edilmiştir. Biz herhangi bir boncuk veya prion çubuklar dalak veya mezenterik lenf düğümleri (veriler gösterilmemiştir) tespit edildi. Toto, bu veriler, bağışıklık hücrelerini trafik diğer partikül antijenleri çok benzer prion göstermektedir.

REAKTİF	Florokrom	İKAZ LAZER (nm)	PEAK EMİSYON (nm)
Prion çubuklar	DyLight 649	633	674
1 mikron boncuk	AlexaFluor 660	633	685
Antikorlar
CD11b	eFluor 450	405	450
	Fikoeritrin-Cy7	488	760
CD11c	R-Fikoeritrin	488	575
	Fikoeritrin-Cy7	488	760
Ly6C	Fluoroisothiocyante	488	518
Ly6G	R-Fikoeritrin	488	575
CD21	DyLight 488	488	518
B220	Allophycocyanin-Cy7	633	785
CD3	R-Fikoeritrin	488	575

"> Tablo 1 floresan reaktiflerin spektral özellikleri

Şekil 1. Enfekte beyin Homojenat prion çubuklar Arıtma Biz toplu prion çubuklar (şerit 3 ve 4) saflaştırılmış hangi malzeme başlangıç ​​olarak bir CWD enfekte geyik (E2, şerit 1 ve 2)% 10 ham beyin Homojenat kullandı. Normal beyin Homojenat (şerit 5 ve 6) bulunmamış iken, ham ve arıtılmış malzemeleri proteaz K tedavisi (4 hat 1) için karakteristik bir direnç gösterdi. Molekül ağırlığı işaretleri leke sol Kd gösterilmiştir. BH, beyin Homojenat.

Şekil 2. Aşılama (panelleri AG ve V-AB), floresan boncuk (HN ve AC-AI) veya Prion çubuklar (OU ve AJ-AP) PBS iki saat sonra periton mediastinal lenf düğümleri bağışıklık hücreleri ticareti prionlar Akış sitometrik analizi peritoneal lavaj sıvısı (AU) ya da iki saat sonra mediastinal lenf düğümleri (V-AP) hasat fareler ve hücrelerin periton içine enjekte edilir. PBS (paneller A ve V), floresan boncuk (panel H ve AC) ve prion çubuklar (paneller O ve AJ) ile tedavi edilen farelerden alınan ilk sütunda göstermek hücrelerinde Grafikler. Floresan hücreleri (kırmızı veya yeşil noktalar) ve toplam hücreleri (siyah nokta) göreceli büyüklüğü (forward scatter), taneciklik (yan dağılım) ve floresan toplam canlı hücreler oranı göstermek için çizilir. Granülosit karakteristik hücrelerin önemli sayıda floresan boncuk ve çubuklar korudu. Hücreler aynı zamanda bağışıklık hücre yüzey işaretleyicileri ve LYG-Ly6C + monositler için kapı (panel B, I, P, W, AD ve AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + nötrofil (C, J, Q, X, AE karşı antikor ile boyandı edildi ve AL), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + dendritik hücreler (D, K, R, Y, AF ve AM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + makrofajlar, (E, L, S, Z, AG ve AN), CD3 -B220 + CD21 + B hücreleri (F, M, T, AA, AH ve AO) ve CD21-B220-CD3 + T hücreleri (G, N, U, AB, AI ve AP). Monositler, dendritik hücreler ve makrofajlar floresan boncuk ve prion çubuklar korudu periton boşluğuna (panelleri I ve P, K ve R ve L, G, sırasıyla) ve mediastinal lenf düğümleri (paneller AD ve AK, AF ve AM ve AG taşınan sırasıyla BİR), bu iki parçacık benzer alımı ve ticareti gösteren. Nötrofiller boncuk (J) ve daha az çubukları (S) önemli bir miktarı korunur, ancak lenf düğümleri (AE ve AL) teslim etmek üzere başarısız oldu. B hücreleri ve taşınan bazı çubuklar (T ve AO) ama hemen hemen hiç boncuk (M ve AH) korudu. T hücreleri boncuk ne çubuklar (N, U, AI ve AP) ne kaçırılmaktadır.

Tartışma

Burada periferik prion enfeksiyonu erken olayları büyük ölçüde takibini kolaylaştıran in vivo etiketleme ve izleme prionlar için bir protokol göstermektedir . Bu protokol, net bir şekilde endojen ^PrP C ayırt etmek için, ön-etiketleme zenginleştirilmiş prion ^inokulum, in vitro 9 ^ve in vivo 3,12 izleme prion alımını geçmişte girişimleri büyük ölçüde geliştirir. Çünkü bulaşıcı prionlar ve PrP ^C aynı birincil amino asit dizilimi payı üreten prion spesifik antikor...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CWD enfeksiyonlu elk beyni	Colorado'da özel bir elk çiftliği		İnsan dışı herhangi bir prion enfeksiyonlu beyin kullanın
Blender	Oster Professional Products	6694-015	Herhangi bir ticari blender kullanın
Santrifüj	Sorvall, Thermo Scientific	SS34 rotoru	3000 x g hıza ulaşabilen ve ≥ 500 ml hacim alabilen herhangi bir santrifüj /rotor kullanın
Ultrasantrifüj	Beckman Coulter Inc.	50.2 Ti rotoru	100,000 x g hıza ulaşabilen ve ≥ 500 ml hacim alabilen herhangi bir ultrasantrifüj /rotor kullanın
Bradford Reaktifi	Sigma-Aldrich	B6916
Komple mini proteaz inhibitör kokteyli	Roche Group	11 836 170 001
Sonikatör	Misonix	MP4000X	Maksimum gücün ~%70'ine ayarlanmış herhangi bir horn veya prob sonikatör kullanın
DyLight antikor etiketleme kiti	Thermo Fisher Scientific, Inc.	53050
Mikrosantrifüj	Eppendorf	55430R	13,000x g değerine ulaşabilen herhangi bir soğutmalı mikrosantrifüj kullanın
Santrifüj filtre kolonları	EMD Millipore	Microcon YM-100	100 Kd moleküler ağırlık kesme sınırına sahip herhangi bir filtre veya diyaliz membranı kullanın
8-40 haftalık FVB fareler	Charles River Laboratories	207	Herhangi bir inbred fare suşu kullanın
1 μm kırmızı floresan boncuklar	Phosphorex	2307	≤ 10 μm boyutunda herhangi bir floresan boncuk kullanın
RPMI 1640 medyumu	Invitrogen	11875-093
40 μm hücre süzgeci	Falcon BD	352340
Floresan antikorlar	BD Biosciences	Çeşitli	Uygulamanıza uygun herhangi bir floresan antikor kullanın.
Akış sitometresi	Dako	CyanADP	Çok renkli floresan deteksiyonu yapabilen herhangi bir akış sitometresi kullanın