Clathrin-aracılı endositoz kargo seçimi ve clathrin kat montaj koordine adaptör proteinler bağlıdır. Burada bir model olarak maya endositik adaptör protein Sla1p kullanarak adaptörü clathrin fiziksel etkileşim ve canlı hücre görüntüleme yaklaşımları incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In vivo ve in vitro Adaptör-clathrin Etkileşim Çalışmaları
Bu makalede
Özet
Özet
Büyük bir endositik yolu taşıma kargo hücre yüzeyinden 1-6 endosomes clathrin kaplı vezikül (CCVs) oluşumunu başlatır. CCVs clathrin kat vezikül membran yüzlü bir kafes seçkin ve mekanik bir iskele olarak hizmet vermektedir. Clathrin kat bireysel clathrin triskelia, üç üç ağır ve hafif zincir alt birimden 7,8 oluşan clathrin çözünür formu vezikül oluşumu sırasında monte edilir. Triskelion doğrudan membran bağlama yeteneği olmadığından, clathrin bağlayıcı adaptörler, lipidler ve / veya membran proteinlerinin 9 dernek aracılığıyla membran oluşturan clathrin kafes bağlamak için kritik öneme sahiptir . Adaptörler ayrıca paket transmembran protein bu reseptörler olarak kargo, ve birbirleri ile ve diğer bileşenleri ile CCV, makine 9 etkileşimde bulunabilirsiniz.
Clathrin adaptörler, yirminin üzerinde tanımlanmıştır birçok clathrin aracılı endositoz katılan ve diğerleri trans Golgi ağa lokalize veya 9 endosomes. HIP1R (maya Sla2p) hariç, tüm bilinen clathrin adaptörleri clathrin ağır zincir 9 N-terminal-pervane etki alanına bağlanır. Clathrin adaptörleri yapılandırılmamış esnek linkers bağlı katlanmış etki oluşan modüler proteinlerdir. Bu ilintileyiciniz bölgeler içinde, kısa bağlayıcı motifleri clathrin vezikül oluşumu makine 9 N-terminal etki alanı veya diğer bileşenler ile etkileşimleri arabuluculuk . İki ayrı clathrin bağlayıcı motifleri tarif edilmiştir: clathrin kutusu ve W-box 9. Konsensus clathrin kutu dizisi ilk olarak tanımlandı L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 varyantları daha sonra 11 keşfedilen edilmiştir. W-box dizisi PWxxW (x herhangi bir kalıntı olduğu) için uygundur.
Sla1p (Cehennem Aktin bağlayıcı protein-1 Sentetik), aslında bir aktin ilişkili protein olarak tanımlanan ve maya hücreleri 12 endositik sitelerinde normal aktin hücre iskeletinin yapısı ve dinamikleri için gerekli oldu . Sla1p NPFxD endositik sıralama sinyali bağlanır ve NPFxD sinyal 13,14 taşıyan kargo endositoz için kritik öneme sahiptir. Daha yakın zamanlarda, Sla1p clathrin kutusu, LLDLQ benzer bir motif ile clathrin bağlamak gösterildi, bir varyant clathrin-box (VCB) olarak adlandırılan ve 15 endositik clathrin bir adaptör olarak işlev. Buna ek olarak, Sla1p endositik canlı hücre floresan mikroskop çalışmaları 16 kat için yaygın olarak kullanılan bir belirteç haline gelmiştir. Burada adaptörü clathrin etkileşim çalışmaları için yaklaşımları tanımlamak için bir model olarak Sla1p kullanabilirsiniz. Biz canlı hücre floresan mikroskopi odaklanmak, aşağı GST-pull ve co-immunoprecipitation yöntemleri.
Protokol
1. SLA1 gen, GFP etiketi ve seçilebilir işaretleyici Incorporation
Doğrudan bir GFP etiketi SLA1 gen açık okuma çerçevesi 3 'sonunda (Sla1p C-terminalindeki) sigorta ve gen E. ile eş zamanlı olarak işaretlemek için 17 Longtine yöntemi uygulayın G418 seçimini sağlar coli kan r gen.
- Ileri, bir şablon olarak plazmid pFA6a-GFP (S65T) kanMX6 18 ve aşağıdaki primerler kullanılarak PCR ile DNA parçası oluşturun: 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 ', ve tersine, 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TTK TAT AAA ATC T....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Clathrin kaplı vezikül (CCV) trans Golgi ağından endositoz ve ulaşım katılmak ve ökaryotik hücre biyolojisi için temel korunmuş yollar endosomes. Bu yöntem kağıt açıklanan yaklaşımlar, adaptör proteinler ve clathrin arasındaki etkileşimler, CCV oluşumu için sorumlu olan moleküler mekanizmalar çalışma yararlıdır. GST-füzyon proteini yakınlık ve ortak immunoprecipitation deneyleri bir adaptör (aday) ve clathrin arasındaki fiziksel ilişki test izin verir. GFP-etiketleme ve floresan mikroskobu görüntüleme canlı hüc.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
DF NSF Köprüler Doktora bursu tarafından desteklenmektedir. Bu çalışmada kullanılan mikroskop Colorado State Üniversitesi Mikroskop Görüntüleme Ağ temel altyapı hibe tarafından kısmen desteklenmektedir. İş yazarı s laboratuvarda clathrin adaptörleri CSU start-up fonları ve SD Amerikan Kalp Derneği ödül 09SDG2280525 tarafından desteklenmektedir
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Malzeme | Şirket | ||
|---|---|---|---|
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| QuickChange-XL site directed mutagenesis kiti | Stratagene | ||
| proteaz inhibitörü kokteyl | Sigma |
Kaynaklar
- Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
- Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
- C....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
