Yöntem makalesi

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

15K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/2365

⸱

3 Ocak 2011

 ,  , 
1National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2School of Life Science, Xiamen University

Bu makalede

Özet

Kemirgen sıtma parazitleri Genetik haçlar sivrisineklerin genetik olarak iki farklı parazitler besleyerek yapılmaktadır. Rekombinant döl sivrisinek enfekte farelerde ısırık izin sonra fare kandan klonlanmış. Bu video genetik haçlar üretmek nasıl gösterir Plasmodium yoelii Ve diğer kemirgen sıtma parazitleri için geçerlidir.

Özet

Antimalaryal yanıt ve sıtma parazitleri, patojenite Varyasyon, biyolojik ve tıbbi önemi. Bağlantı haritalama 1-3 kemirgenler ve insanlarda 4-6 sıtma parazitleri çeşitli özelliklerin altında yatan gen veya lokusların başarılı tanımlanmasına yol açmıştır. Sıtma paraziti Plasmodium yoelii vahşi Afrika kemirgenler izole birçok sıtma türlerinin biridir ve laboratuvarlarda büyümeye adapte edilmiştir. Bu tür birçok insan sıtma parazitlerinin biyolojik özellikleri yeniden üretmesidir; parazit 7-9 mikrosatellit ve amplifiye parça uzunluk polimorfizmi (AFLP) işaretleyicileri gibi genetik belirteçleri için geliştirilmiştir. Böylece, kemirgen sıtma parazitleri Plasmodium falciparum araştırma tamamlamak için genetik çalışmalar yapılabilir. Burada, P. genetik bir çapraz üretmek için teknikler göstermektedir yoelii ilk kez Dr tarafından öncülük edilmiştir . David Walliker Richard Carter ve arkadaşları 10, Edinburgh Üniversitesi.

P. de Genetik haçlar yoelii ve diğer kemirgen sıtma parazitleri ilgi fenotipleri ve sivrisinek, 4 gün sonra enfeksiyon enfekte fareler üzerinde beslemek için izin vererek farklı genetik olarak farklı iki klonların gametocytes içeren bir inokulum ile enfekte fareler Mus musculus tarafından yapılmaktadır . Erkek ve dişi fare kan gametocytes varlığı mikroskobik beslemeden önce teyit edilir. Beslenmeden sonra 48 saat içinde, sivrisinek midgut, haploit gametocytes, erkek ve dişi eşey hücrelerinin içine ayırt döller ve diploid zigot formu (Şekil 1). Bir ookinete bir zigot gelişimi sırasında, mayoz 11. meydana görünür. Zigot genetik olarak farklı iki parazitler, genetik değişim (homolog kromozom çiftinin olmayan kardeş kromatidler arasında kromozomal reassortment ve cross-over; Şekil 2) gamet arasındaki çapraz döllenme yoluyla elde edilen ise, rekombinasyon sonuçlanan oluşabilir homolog lokusların genetik materyal. Her zigot dört haploit çekirdeklerin önde gelen, birbirini izleyen iki nükleer bölünmeler uğrar. Bir ookinete daha bir ookist içine geliştirir. Ookist olgunlaştıkça sonra, sporozoites (çapraz döl) binlerce oluşan ve sivrisinek hemoceal salınır. Sporozoites tükürük bezleri hasat öncesi eritrosit ve eritrosit aşama bir gelişme gerçekleşir yeni bir fare ev sahibi, içine enjekte edilir. Eritrosit formları klonlanmış ve genetik bağlantı haritalama önce ebeveyn hatları ayırt edici karakter bakımından sınıflandırılır. Bireysel ebeveyn klonların Kontrol enfeksiyonlar, genetik çapraz üretim olarak aynı şekilde yapılmaktadır.

Protokol

Farelere deneysel sonuçların bulandırabilir eksojen enfeksiyöz ajanların yanlışlıkla giriş önlemek için hayvanlar içine yönetilmektedir olacak bütün malzemeleri aseptik teknikler uygulanmalıdır.

1. Kan sahne Sıtma Parazitler Laboratuvar Fare Enfeksiyon

  1. Oda sıcaklığında çözünme, dondurulmuş kan sahne sıtma parazitleri içeren iki şişeleri geçilebilir. Bu örnekte, iki kemirgen sıtma paraziti suşları Plasmodium yoelii yoelii ve Plasmodium yoelii nigeriensis.
  2. Fit bir şırınga ve bir 22-30 gauge (G) iğne ile steril, ilaç sınıf PBS (pH 7.4) 400 mcL hazırlamak.
  3. Içerik homojen olarak karıştırılmış kadar şırınga kadar ters ve aşağı aynı şırıngayı kullanarak, 100 mcL çözülmüş enfekte kan hazırlamak. (Opsiyonel: Bir pipet enjeksiyon için bir şırınga içine aktarılmadan önce bir toplama tüpüne PBS ve enfekte kan aktarmak için kullanılır olabilir).
  4. Parazit doğrudan bir fare periton içine solüsyon içeren 200 mcL enjekte edilir. Bittiğinde, kavuz bin şırınga atın. (Laboratuar farelerine bakım için Ek Malzemeleri). Genel olarak, standart inokulum boyutu orijinal dondurulmuş malzeme parazit enfeksiyonları düzeyleri bağlı olarak, 100-500 mcL arasında.
  5. Iki fareler her geçtiler iki parazit suşları enjekte edilir. Fareler enjeksiyondan sonra 3 ila 5 gün mikroskobik pozitif olacak. % 1-5 arasında parasitemias ulaştığınızda, bir sonraki adıma geçin.

2. Fare Karma Clone Enfeksiyon

  1. Karışık klon enfeksiyonu önce, mikroskobik inceleme Giemsa lekeli Kan frotilerinin (Şekil 3) farklı parazit suşları ile enfekte olan iki donör farelerden alınan kuyruk kan toplamak ve kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümü için (ayrıntılı yordamlar için Yardımcı Malzemeler) .
  2. Daha önce elde edilen parasitemia ve kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümleri kullanarak, serum fizyolojik (% 1.5 w / v trisodyum sitrat dihidrat, 0.85% w / v sodyum klorür) ve inokulum karışımı üretmek için gerekli fare kan hacmi hesaplayın.
  3. 100μl başına bir milyon bulaşmış kırmızı kan hücrelerinin bir final konsantrasyon parazit çözüm ayarlayın.
  4. Karışık bir klonu inokulum elde etmek için iki vericilerden 1:1 oranında enfekte kan birleştirin. Iki ebeveyn klonların büyüme hızında farklılık, oranlarını ayarlamak 1:2 veya 1:5 yavaş büyüyen bir ebeveyn klonu ebeveyn hızlı büyüyen bir.
  5. Enfekte olduğu için her fare periton içine karışık örnek 100 mcL enjekte edilir. (3.9 adım enjekte edilen farelerin sayısını belirlemek için ayrıca bkz.)
  6. Bu yöntemi kullanarak, tek ebeveyn suşları ile her iki fareleri enfekte. Tek klonu enfeksiyonları iki ebeveyn suşlarının başarılı iletim belirlenmesine olanak sağlayacaktır.

3. Besleme Sivrisinekler

  1. 300-500 yetişkin (erkek ve kadın), pupa gelen Anofel stephensi sivrisinekler, her yaş sonrası 5-7 gün ortaya çıkması içeren üç kafesleri hazırlayın. Kapları, plastik ya da metal kapağı güvenli file ile kaplıdır. İki kafesleri ebeveyn klonlar beslemek için; üçüncü kafes genetik bir haç hazırlanması için.
  2. Karma klonu enfeksiyon dört gün sonra başlayarak, enfekte olmuş fareler Giemsa lekeli ince kan kuyruk smear hazırlamak.
  3. 1000x büyütme en az 50 mikroskobik alanları tarayarak, bir mikroskop altında smear incelemek ve erkek ve kadın gametocytes mevcut olup olmadığını belirlemek.
  4. Erkek ve kadın gametocytes büyük vakuol ve büyük granüller (Şekil 3) varlığı nedeniyle dikkatleri üzerine çekiyor. Erkek ve kadın gametocytes sırasıyla, pembe ve mavi sitoplazma var. Gametocytes varsa, 3.6 adım izleyin.
  5. Gametocytes yok ise, günlük izleme göründükleri kadar tutun. Gametocytes varsa, aşağıdaki adımla devam edin.
  6. 50 mcL ketamin ve 3 mg / ksilizin ml her enfekte fare (20 gram fare vücut ağırlığı başına) uyutmak için bir fare periton içine 33 mg / ml içeren anestezik ilaç kokteyli enjekte edilir. Final doz ketamin ve ksilizin sırasıyla 82.5 ve 7.5 mg / Kg.
  7. Fareler 24 saat açlık ve şeker kaynağı sivrisinek kesinti olmadan 30 dakika boyunca beslemek için izin yetişkin Anofel stephensi sivrisinek içeren bir kafesin üstünde yüz aşağı yerleştirin.
  8. Standart koşullar (laboratuvar sivrisinek bakım için Ek yöntemleri sıcaklığı 24-26 arasında tutulur ° C) altında bir insectary sivrisinek koruyun.
  9. Her 50-100 dişi sivrisinekler için bir enfekte fare kullanın. Fareler anestezi altında iken, beslenme sonrasında servikal dislokasyon farelerin hemen Euthanize.

4. Diseksiyon Sivrisinek Midguts ve Sayma ookistleri

  1. Besleme dokuz gün sonra, sivrisinek, böcek midgut ookistleri için ele alınacaktır. Tek klonu enfekte fareler üzerinde beslenen iki ebeveyn suşlarının bu gametocytes gösterir sivrisinek ookistleri varlığı bulaşıcıdır.
  2. Bir sivrisinek midgut incelemek için, 5-10 enfekte sivrisinek kafes toplamak için küçük bir kapta bağlı bir aspiratör kullanın.
  3. CO 2 gazı kullanılarak, sivrisinek uyutmak ve buz üzerinde bir cam petri kabı içine aktarabilirsiniz. Ayrı ve erkek sivrisineklerin atın. Antenler erkeklerde kadınlara oranla belirgin şekilde bushier vardır.
  4. PBS ile iki şırınga doldurun ve 26 göstergesi yarım inç (G ½) iğne ile bunlara uyan. Mevduat bir cam slayt üzerine bir şırınga PBS yaklaşık 100 mcL.
  5. PBS damla üzerine aktarın ve 5 ila 10 anestezi dişi sivrisineklerin diseksiyon mikroskobu slayt yerleştirin.
  6. Aynı iğneler kullanarak, toraks ve arka karın böcek tutan, daha sonra, her bir sivrisinek kanatlarını ve bacaklarını kaldırmak dışında vücudun midgut, beyaz bir kese gibi vücut yayınlandı kadar çekin. Midgut ayırın ve vücudun geri kalanı atın.
  7. Slaytlar kuru midgut hakkında daha fazla PBS ekleyin. Kurutulmuş izin verirseniz midgut dejenere olacaktır. Midguts üzerinde bir kapak kayma yerleştirin.
  8. 100x büyütmede ışık mikroskobunda midguts inceleyin. (Şekil 3) her midgut ookistleri sayıları sayma. Ookistleri midguts dış yüzeyinde yer alan kalın duvarlı yuvarlak yapılar olarak dikkatleri üzerine çekiyor.
  9. Tamamlandığında, şırıngalar, iğneler, ve bir dikiş iğnesi bin slayt atmayın.
  10. Ookistleri midguts yok ise, yüksek sayıda gametocytes ile enfekte fare ile sivrisinek beslemek ve daha uzun bir beslenme zaman vermek. Sıcaklık bu adım için kritik öneme sahiptir. Sıcaklık 24 - 26 ° C'de ayarlanmış olduğundan emin olun.

5. Santrifüj tarafından Sivrisinekler Sporozoites toplanıyor

  1. Aşağıdaki gibi sporozoite toplama tüpleri hazırlayın: 0.5 mL temiz bir santrifüj tüpüne kapağı kesme ve Alevli 19 G iğne kullanılarak tüp dibinde (0.1-0.2 mm çapında) bir delik yumruk.
  2. 1 / 3 'tüp cam yünü ile doldurun. (~ 100 sivrisinek hasat sporozoites için yeterli bir tüp), 1.5 ml toplama tüpünün içine filtre tüp takın
  3. Gün 17 Mesaj beslenme, küçük bir kap içine bir aspiratör kullanarak kafesleri sivrisinek (Adım 4) toplamak.
  4. CO 2 gaz, sivrisinekler uyutmak için kullanın .
  5. Erkek sivrisineklerin dişileri ayırın. Buz üzerinde bir cam petri kabı konteyner anestezi dişi sivrisinekler aktarın.
  6. PBS ile dolu, 26 G ½ iğne ile iki şırınga hazırlayın . Mevduat bir cam slayt üzerine bir şırınga PBS yaklaşık 100 mcL.
  7. Sivrisinekler bir mikroskop lamı üzerine aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında sivrisinek 'kafa, kanatlar, bacaklar ve karın çıkarın.
  8. Ince uçlu forseps kullanma, 1.5 ml homojenizatör (havanda) 0.5 ml PBS thoraxes transfer. (Sporozoite 2-3 saat için infektif kalır) thoraxes buz üzerinde saklayın.
  9. (Bkz. Şekil 3), tükürük bezlerinin sporozoites serbest bırakmak için buz üzerinde thoraxes homojenize ve cam yünü (Adım 5,1-5,2) bir cam pipet kullanarak dolu tüpe ilginçtir (homojenatlarında) aktarmak.
  10. Oda sıcaklığında 1000 rpm'de 10 ila 20 saniye boyunca santrifüjleyin.
  11. Toplayın akış yoluyla 22-30 G iğne ile (saflaştırılmış sporozoite süspansiyon) bir şırınga kullanarak. (Opsiyonel: damla 10-50 mcL akış ile mikroskopik bir slayt, bir kapak, 400X büyütme standart bir ışık mikroskobu altında canlı sporozoites kayma ve görselleştirmek yer, ayrıca bkz Şekil 3)
  12. Fareler (bkz. ref 12 kadar 200.000 parazitler tek bir sivrisinek hasat edilebilir) içine sporozoite süspansiyon ip 0.1-0.5 ml enjekte edilir. Başarılı bir durumda, hayvanın bir enjeksiyondan sonra 72 saat enfekte olacak.

6. Sınırlı Seyreltme kullanarak Klonlama Döl

  1. Sporozoite enjeksiyondan sonra yetmiş iki saat, Kan frotilerinin Giemsa boyama sonrası ve kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümü için mikroskobik inceleme için farklı parazit suşları (ayrıntılı yordamlar için Yardımcı Malzemeler) ile enfekte iki donör farelerin kuyruk kan toplamak.
  2. % 0.1 ila 1 parasitemia gösteren bir fare seçin ve enfekte kırmızı kan hücreleri, klonlama işlemi için bir bağış olarak çoğunlukla tek parazitleri içerir. Farelerin mikroskobik negatif ise 6.1 önümüzdeki günlerde adımı yineleyin. Hayvanlar 14 gün içinde enfekte değilse) 5 Adım 2 tekrarlayın ve adım 5.11 sporozoites varlığını belirlemek.
  3. Buzağı serum ve memeli Ringer solüsyonu (2.7 mM potasyum klorür, 1.8 mM kalsiyum klorür, 154 mM sodyum klorür) soğuk bir çözüm 01:01 hasat kuyruk kan sulandırınız kadar, con ulaşmak1 bulaşmış kırmızı kan 100 mcL başına hücre ve buz üzerinde inokulum saklamak için 0,6 santrasyondan. Bu şekilde, bireysel fare çoğu ya bir veya sıfır parazitler almalıdır.
  4. Intravenously, her 50 ila 100 farelerin seyreltilmiş enfekte kan 100 mcL enjekte.
  5. Beş ila yedi gün sonra fareler, Giemsa lekeli Kan frotilerinin inceleyerek kan sahne parazitlerin varlığı için ekran. Başarılı bir deneyde, farelerin% 20-50 enfekte olmakta ve% 0,1-5,0 gün 8 yazılan enfeksiyon parasitemia gösterecektir.

7. Genetik Markers kullanarak Döl Karakterizasyonu

  1. 0.2 mL soğutulmuş fizyolojik sitrat salin solüsyonu, vorteks kısaca ve pelet kan hücreleri için oda sıcaklığında 3000 rpm'de 3 dakika santrifüj içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 20 ila 40 mcL fare kuyruğu kan toplayın. Hemen DNA özü veya -80 ° C pelet tutmak
  2. Parazit DNA herhangi bir standart DNA ekstraksiyonu yöntemleri kullanarak hazırlayın. Hızlı DNA izolasyonu için, bir Yüksek Saf PCR şablon hazırlık seti (Roche Uygulamalı Bioscience) kullanın.
  3. Rekombinant döl mikrosatellit (MS) veya farklı kromozomlar üzerinde genetik çapraz iki ebeveyn suşları ayırt tek nükleotid polimorfizmi (SNP) kullanarak genotipleme sonra tespit edilir. P. MS genotipleme için tek floresan etiketli primerler kullanılarak basitleştirilmiş bir yöntem yoelii (bkz. ref 8,9) kullanılmalıdır.

8. Kan aşamalı Sıtma Parazitler, Kriyoprezervasyon

  1. 5-10 ml% 5-20 parasitemia ile bir anestezi fare kalp ponksiyonu ile enfekte kan toplayın 0.5-1 ml serum fizyolojik solüsyonu soğutulmuş.
  2. Oda sıcaklığında 2000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatant atın.
  3. Glycerolyte 57 çözüm açılan bilge 2x hacmi (Fenwal Laboratories) kan pelet üzerine ekleyin ve iyice karıştırın.
  4. Süspansiyon (tüp başına 0.2-0.5 ml) cryotubes aktarın.
  5. -80 ° C'ye kadar (1 ay) sıvı nitrojen ya da Kriyoprezerve kan saklayın.

9 - Temsilcisi Sonuçlar:

Başarılı bir deneyde, klonlanmış hatların% 5-10, bağımsız rekombinant döl olacaktır.

Şekil 1
Şekil 1, genetik çapraz sırasında yaşam döngüsü ve genetik rekombinasyon olayları şematik . Genetik rekombinasyon olayları sivrisinek gelişiminin erken aşamasında yer alır. Sivrisinek midgut farklı genetik kökenden "haploid" erkek ve dişi eşey hücrelerinin döllenme sonrasında, "diploid" zigot oluşur. Zigot, parazitin yaşam döngüsünün sadece diploid aşamasını teşkil etmektedir, mayoz bölünme, döllenme 12 saat içinde izler ve sivrisinek ve memeliler sonraki tüm aşamalarında haploid kalır. Ortaya çıkan zigot ookinetes ve ookistleri dönüşebilir. Büyüme ve mitoz bölünme her ookist sivrisinek 'hemoceal salınan sporozoites binlerce üretir. Tükürük bezlerinin göç olanlar sporozoites, karaciğer ve kırmızı kan hücre aşamalarında gelişme gerçekleşir bir konak memeli, iletilebilir konumda bulunmaktadır. Kırmızı kan hücre siklusu seyri sırasında, bazı parazitler, olgun erkek ve kadın gametocytes ayırt edebilirsiniz. Bu gametocytes başka bir sivrisinek, sürdürmekte iletim tarafından alındığında, parazitin yaşam döngüsü tamamlanmış olur.

Şekil 2
Şekil 2, sıtma parazitleri ve rekombinant döl üretiminde nükleer genlerin Devralma . Genetik rekombinasyon kromozomal reassortment yoluyla veya çapraz olaylar oluşturulabilir. Homozigot döl aynı ebeveyn klon 1 veya 2 (A ve D), sırasıyla gamet arasında selfing tarafından üretilen. B) İki farklı ebeveyn klonlar, sadece kromozom reassortment tarafından oluşturulan rekombinant çekirdekleri (mavi oval) gamet arasındaki çapraz döllenme tarafından üretilen heterozigot döl. C) homolog kromozomların kardeş olmayan kromatidler arasındaki geçitler tarafından oluşturulan iki farklı ana klonlar, rekombinant çekirdekleri (kırmızı oval) gamet arasındaki çapraz döllenme üretilen heterozigot döl.

Şekil 3
Şekil 3 kemirgen sıtma paraziti Plasmodium yoelii morfolojisi. 10 gün sonrası ookistleri A) halka aşaması, B) trophozoite, C) schizont, D) merozoites, E) olgunlaşmamış erkek gametocyte, F) olgun erkek gametocyte G) olgunlaşmamış dişi gametocyte, H) olgun kadın gametocyte, I) midgut besleme (oklarla gösterilen olgun ookistleri, 200x büyütme), J) sivrisinek tükürük bezleri (100x büyütme), K) sporozoites (400x büyütme).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz, aynı zamanda diğer kemirgen malarias genetik haçlar üretimi için geçerli kemirgen sıtma Plasmodium yoelii, genetik bir haç üretim teknikleri göstermektedir. Tek ebeveyn klonları ile farelerin enfeksiyonları genellikle ebeveynlerin çapraz yapmadan önce fonksiyonel gamet üretiminde yetkin olmalarını sağlamak için ebeveyn parazitlerin başarılı iletim belirlemek için yapılmaktadır.

Başarılı bir sivrisinek yoluyla aktarımı insectary sıcaklığı, kullanılan kemirgen sıtma parazitleri t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, kamu çalışanları ve bu bir hükümet çalışması olduğundan, Amerika Birleşik Devletleri'nde kamu malı. Başka herhangi bir anlaşma ile bağlı kalınmaksızın, NIH görüntülemek için PubMedCentral çalışmalarını sağlamak ve kamu tarafından kullanılması hakkını saklı tutar ve töreleri ile PubMedCentral tutarlı çalışma etiket veya değiştirebilir. ABD konunun dışında bir hükümet kullanım lisans hakları kurabilir.

Teşekkürler

Dr Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey Dan Pare ve Tovi Lehman el yazmaları eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu çalışma ve 973 Çin Ulusal Temel Araştırma Programı, # 2007CB513103 İntramural İntramural Araştırma Bölümü Araştırma Programı, Ulusal Enstitüsü Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir. NIAID intramural editörü Brenda Rae Marshall yardım için teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Yardımcı Malzemeler:

  • Laboratuar farelerine Bakım
  • Laboratuvar sivrisinek Bakım
  • Giemsa ile boyanmış Kan frotilerinin mikroskobik muayene leke
  • Kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümü

Laboratuar farelerine Bakım

Kendilenmiş laboratuar faresi zorlanma 5 ila 8 hafta yaşlı BALB / c, Kadınlar çalışmaya kullanılır. Fare, besleyici ve bir su şişesi ile donatılmış tel bar kapaklı bir standart alt katı polikarbonat kafes, ev sahipliği yapmaktadır. Fare sabit bir sıcaklıkta korunur (25 ± 1 ° C) 00:12 saat ışık karanlık döngüsü. (Sterilize; Harlan-Teklad) Fare 2018S Harlan Teklad Küresel% 19 protein ekstrüde kemirgen diyet beslemek için izin verilir ve asitlendirilmiş içme suyu ad libitum ile birlikte. Hayvanlar üzerinde deney protokolü LMVR11E (Sağlık, Bethesda, Maryland Ulusal Sağlık Enstitüleri) altında Ulusal Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmaktadır.

Laboratuvar sivrisinek Bakım

Sivrisinek Anofel stephensi bir laboratuarda yetiştirilmiş koloni. Yetişkinler, bir sıcaklık ve nem kontrollü odası (25 ila 23 saklanır naylon kafeslerde korunur ° C ve Plasmodium yoelii ve Plasmodium chabaudi için 21 ila 19 ° C Plasmodium berghei; 80 -% 95 nem ; 12:12 saat ışık: karanlık döngüsü). Yetişkin sivrisinek% 10 glikoz ve% 2.00 'para-aminobenzoik asit (PABA) takviye su solüsyonu ile beslenir. Yüksek kaliteli yetişkin elde etmek için yaklaşık 1 mg sodyum bikarbonat ile birlikte 1000 cm 3 açık çanak, distile su ile 1 L düşük yoğunluklu bir durumda, 500 larva yetiştirilmektedir. Yumurtadan çıkan larvalar pupa aşaması haline kadar Tetramarin tozu (Petco) verilmiştir ve gelişmekte olan erişkin sivrisinek kafeslerine aktarılır.

Giemsa ile boyanmış Kan frotilerinin mikroskobik muayene leke

Temiz bir makas kullanarak enfekte fare kuyruğunun ucu (1.0 mm) snip. Yeri bir damla temiz bir örnek slayt üzerine kuyruk kan (0.5-1.0 mcL). Fare 1-2 dakika içinde kanama durur. Numune slayt 45 ° açıyla bakımı, kan damlası üstüne temiz bir dağıtıcı slayt yerleştirin ve kan serpme tüm genişliği tutunmasını sağlar. Örnek slayt tutun ve ince yayma üretmek için hızlı ve sorunsuz bir dağıtıcı slayt ileri itin. Kan filmi kurumasını bekleyin ve daha sonra mutlak metanol slaytlar batırmayın. Giemsa boyama (% 10 distile su Giemsa boyası) ile kaplayıp önce bir kez daha kuru hava slayt izin verin. Ince kan filmler 10-15 dakika oda sıcaklığında inkübe sonra, musluk suyu ile dikkatlice slaytlar yıkayın ve kuru, hava sağlar. 1000x büyütme (100x objektif lens ile birlikte) ve hesaplamak parasitemia (RBC sayılır 100 iRBC ortalama sayısı) immersiyon yağı ile hafif bir mikroskop altında; bulaşmış kırmızı kan hücreleri (enfekte eritrosit morfolojisi bkz. Şekil 3 iRBC) sayısı inceleyin. Sıtma parazitlerinin farklı türlerin büyüme oranı ve patojenite değişir. Kan aşamasında sıtma parazitleri doza bağlı olarak kan aşamada parasitaemias izlenmesi, enjeksiyondan sonra 24 saat gerçekleştirilen olabilir. Örneğin, 10 7 enfekte RBC intraperitoneal veya intravenöz 10 6 enfekte RBC ile enjekte edildiğinde farelerin mikroskobik olarak pozitif 24 saat olacak.

Kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümü

Parasitaemias, enfekte farelerde kırmızı kan hücre (RBC) yoğunluk seviyeleri gibi enfeksiyon seyri boyunca değişir. RBC yoğunluğu tek ve karma klonu enfeksiyonunun başlangıç ​​ve klonlama deneyleri önce 1-2 saat içinde ölçülmelidir. RBC yoğunluğu ölçümü için iki yöntem vardır: Cellometer kullanarak Neubauer hemasitometre ve otomatik sayma (Nexcelom Bioscience) kullanarak bir manuel sayım. Her iki yöntemde de, fare kuyruğu kan kılcal bir cam (VWR) kullanarak 1 mcL çekilme ve 10 ml PBS içinde sulandırmak ve iyice karıştırın. Neubauer hemasitometre kullanmak için, süspansiyon 20 mcL hemasitometre üzerine yerleştirin. 10x objektif lens ile ışık mikroskobu hemasitometre yerleştirin. Hemasitometre 16 küçük kareler daha ayrılır, 9, büyük meydanlar, ve 4 büyük köşesinde kareler ayrılmıştır bir tablo içerir. 16 küçük kareler her dört köşe kareler hücrelerinin toplam sayısını sayın. Önyargı sayma ya da bir grid çizgisi üst üste hücreleri sayma önlemek için, "" olarak hücre sayımı örtüşür, üst veya sağ çizgiler ve "out", alt ya da sol hatları örtüşür. Küçük bir kare başına hücrelerinin sayısını tahmin etmek ve 0.00625 (küçük bir kare hacmi 6.25 nL) bölün. Bu mikrolitrelik başına hücreleri (& numarasını verir.mu; L). Bu verilere göre, 10.000 (seyreltme faktörü) ile çarpılarak son kırmızı kan hücre yoğunluğu hesaplar. Kuru hava, saf su ve% 70 etanol ile kapak kayma ve sayma odasına durulayın. Alternatif olarak, bir Cellometer sayma odası slayt üzerine süspansiyon 20 mcL yükleyin. Slayt Cellometer slayt odası (okuyucu) içine yerleştirin. Cellometer yazılımını başlatın "kırmızı kan hücresi" seçeneğini seçin ve 10.000 seyreltme faktörü girin. RBC yoğunluğu kaydedin.

Kaynaklar

  1. Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).
  2. Cravo, P. V. Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).
  3. Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved? Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).
  4. Yuan, J. Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum. Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).
  5. Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa. Cell. 91, 593-603 (1997).
  6. Hayton, K. Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion. Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).
  7. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite. Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).
  8. Li, J. Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites. Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).
  9. Li, J. Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method. Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).
  10. Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. Genetic recombination in malaria parasites. Nature. 232, 561-562 (1971).
  11. Sinden, R. E., Hartley, R. H. Identification of the meiotic division of malarial parasites. J Protozool. 32, 742-744 (1985).
  12. Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. J Parasitol. 70, 831-833 (1984).
  13. Yoeli, M., Most, H., Bone, G. Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus. Science. 144, 1580-1581 (1964).
  14. Landau, I., Boulard, Y. Life cycles and Morphology. , Academic Press. London/New York/San Franciso. (1978).
  15. Vanderbergh, J. P. Y., M, Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. J Parasitol. 52, 559-564 (1966).
  16. Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami. Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).
  17. Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. ene encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).
  18. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria. PLoS One. 2, e857-e857 (2007).
  19. Mackinnon, M. J., Read, A. F. Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi. Evolution. 53, 689-703 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Plasmodium yoeliiSivrisinek BeslemeSporozoit HasadKan Evresi ParazitleriGametosit TespitiOokist Olu umuSporozoit EnjeksiyonuS n rl Dil syon

İlgili makaleler