Bakteriyel Enfeksiyona Bağlı Amiloidlerin Tiyoflavin T Floresansı Kullanılarak Ölçülmesi

Özet

Kaynak: Balczon, R., ve diğerleri. Pulmoner Endotel Hücrelerinin Pseudomonas aeruginosa Tarafından Enfeksiyonunu Takiben Sitotoksik Amiloidleri Saptama Yöntemleri. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, amiloid beta tabaka yapılarına bağlanan bir floresan boya olan tiyoflavin T kullanılarak, virülan bakterilerle enfekte olmuş pulmoner endotel hücrelerinden alınan kültür süpernatantlarındaki amiloidleri ölçmek için protokolü göstermektedir. Başlangıca kıyasla floresandaki bir artış, kültür süpernatanında amiloidlerin varlığını gösterir.

Protokol

1. Sitotoksik Süpernatanların Analizi

1. Bir tiyoflavin T (ThT) testi yapmak için, süpernatanlardaki amiloidleri ölçmek için ThT floresansını kullanın. Bu ölçümler için filtreyle sterilize edilmiş süpernatanlar kullanın.
   1. 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 8 mg ThT süspanse ederek bir stok ThT çözeltisi (50x) hazırlayın. Karıştırdıktan sonra, partikülleri gidermek için çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.
   2. Ölçümler için, 1 mL'lik bir spektrofotometre küvetinde 1 mL PBS'ye 20 μL ThT stoğu ekleyin. Seyreltilmiş numuneyi bir spektroflorometreye yerleştirin.
   3. 425 nm uyarma kullanarak temel floresan emisyonunu ölçün ve floresan emisyonunu 450-575 nm'den 2 nm'lik artışlarla tarayın.
   4. 425 nm uyarma ve 482 nm emisyon kullanarak hızlandırılmış tarama gerçekleştirin ve veriler 0.2 saniye boyunca 60 saniyede bir elde edildi.
   5. Hızlandırılmış taramanın ilk 20 saniyesi, boş küvetteki floresansı ölçer. 20 saniyede taramayı duraklatın ve küvete 10 μL filtre ile sterilize edilmiş süpernatant ekleyin. Küveti ters çevirerek karıştırın ve ardından tekrar spektroflorometreye yerleştirin.
   6. Son 40 saniyelik verileri alarak zamana dayalı taramaya devam edin.
   7. Hızlandırılmış taramanın tamamlanmasının ardından, adım 1.3'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi aynı ayarları kullanarak son bir floresan emisyon spektrumu taraması gerçekleştirin.

Malzemeler