Bakteri Suşları Arasındaki Rekabetçi Etkileşimleri İncelemek için Coincubation Testi

Özet

Kaynak: Speare, L., ve diğerleri. Vibrio fischeri İzolatları Arasındaki Rekabetçi Etkileşimleri Ölçmek için Coincubation Asword. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, bakteri suşlarının ortak bir ortamda nasıl rekabet ettiğini incelemek için kullanılan bir ortak inkübasyon testini göstermektedir. Bu etkileşimleri yönlendiren temasa bağlı veya temastan bağımsız öldürme gibi mekanizmaları tanımlamak için mikrobiyolojide yaygın olarak uygulanır.

Protokol

1. Kuluçka suşları (Şekil 1B, C)
   1. Etiketli bir 1,5 mL santrifüj tüpüne her bir suştan 100 μL (OD 1.0'a normalleştirilmiş) ekleyerek referans suşu ve rakip suşu 1:1 oranında (v/v) karıştırın. Bir kontrol olarak, referans suşu kendisinin diferansiyel olarak etiketlenmiş bir versiyonuyla karıştırın (referans suşu pVSV102 + referans suşu pVSV208). Bu kontrol, rakip bir suşun varlığının referans suşun büyümesini etkileyip etkilemediğini belirlemek için daha sonraki istatistiksel analizler için gereklidir. Karışık suş kültürünü 1-2 saniye vorteksleyin.
      NOT: Başlangıç oranı sonuçları önemli ölçüde etkileyebileceğinden ve ayarlanması gerekebileceğinden bu adım optimizasyon gerektirebilir.
   2. Her biyolojik kopya için 1. adımı tekrarlayın. Bu adımı tamamladıktan sonra, toplam sekiz karışık gerinim tüpü olmalıdır: diferansiyel olarak etiketlenmiş referans suşlara sahip dört biyolojik kopya (kontrol) ve diferansiyel olarak etiketlenmiş referans ve rakip suşlara sahip dört biyolojik kopya (deneysel).
   3. Her kontrol ve deney karışımından 10 μL'yi LBS agar içeren Petri plakalarına yerleştirin; Bu kültür noktaları, inkübasyondan sonra floresan mikroskobu için kullanılacaktır.
   4. Tüm sıvı agar tarafından emilene kadar lekelerin tezgahta tamamen kurumasını bekleyin ve Petri plakalarını 24 °C'de 24 saat inkübe edin. için en az 15 saat gereklidir V. fischeri pVSV102 ve pVSV208 ile etiketlenmiş suşların, bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak popülasyon düzeyinde sırasıyla yeşil floresan proteini (GFP) ve kırmızı floresan proteini (RFP) görselleştirmek için yeterince yüksek bir hücre yoğunluğuna büyümesi gerekir. Burada, karışık noktaları görüntülemek için 24 saatlik bir inkübasyon kullanıyoruz.
      NOT: Çok nemli veya çok kuru olmayan tabakların kullanılması önemlidir. Plakalar çok nemliyse, madeni para kuluçka noktaları agar plakasına emilmeyecektir; Aynı gün dökülen tabakları kullanmaktan kaçının. Plakalar çok kuruysa, agar yüzeyinde küçük dalgalar veya çatlaklar oluşabilir ve bu da sikke kuluçka noktalarının şeklini düzensiz hale getirir.

Sonuçlar

Şekil 1: Coincubation testini gösteren akış şeması. (A) pVSV102 (referans suş Ref. Strain veya R.S. ile gösterilir) veya pVSV208 (rakip suş Comp. Strain veya C.S.) barındıran bakteri suşları, referans suş (LBS Kan) veya rakip suş (L...

Malzemeler