$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kaplama testi
NOT: Kaplama testi, kültür örneklerinde koloni oluşturan bir birim (CFU) oluşturabilen hücrelerin konsantrasyonunu ölçer. Bu prosedür, bir hücrenin iki canlı hücreye bölünme hızını ortaya çıkarır ve hücre bölünmesi durukluklarının saptanmasına izin verir (örneğin, hücre lizizinin bakteri üretim süresinde bir artış).
- Taze ortamda 200 μL kültür numunesinin 10-7'sine kadar 10 kat seri seyreltme hazırlayın. 37 °C'de gece inkübasyonundan sonra 3−300 koloni elde etmek için seçici olmayan Luria-Bertani (LB) agaroz plakaları üzerinde uygun seyreltmenin 100 μL'sini plakalayın.NOT: Bakteri bölünmelerini sınırlamak için taze ortamda seri seyreltme hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Alternatif olarak, araştırmacılar seyreltme işlemi sırasında hücre bölünmelerini önlemek için karbon kaynağı olmayan bir tuzlu su çözeltisi kullanmayı düşünebilirler.
- Ertesi gün, her kültür örneğindeki canlı hücrelerin konsantrasyonunu (CFU/mL) belirlemek için koloni sayısını sayın. CFU/mL'yi tedavi edilmemiş ve tedavi edilmiş hücre kültürleri için zamanın bir fonksiyonu olarak çizin.
2. Akış sitometrisi
NOT: Aşağıdaki bölüm, akış sitometrisi analizi için hücre örneklerinin hazırlanmasını açıklamaktadır. Bu analiz tekniği, çok sayıda hücre için hücre boyutunun ve DNA içeriğinin dağılımını ortaya çıkarır. Mümkün olduğunda, akış sitometrisi örneklerinin hemen işlenmesi önerilir. Alternatif olarak, numuneler buz üzerinde tutulabilir (6 saate kadar) ve günün sonunda, kaplama ve mikroskopi görüntüleme yapıldıktan sonra aynı anda analiz edilebilir.
- 4 °C'de taze ortamda ~15.000 hücre/μL (OD600nm ~0.06'ya karşılık gelir) konsantrasyonda 250 μL elde etmek için 250 μL kültür numunesini seyreltin.
NOT: Buz üzerinde inkübasyon, hücrelerin büyümesini ve morfolojik modifikasyonunu sınırlayacaktır. Alternatif olarak, kullanıcı, genellikle akış sitometrisi için önerildiği gibi, hücrelerin %75 etanol içinde fiksasyonunu gerçekleştirmeyi düşünebilir. - DNA boyama için, bakteri örneğini 10 μg/mL'lik bir DNA floresan boya çözeltisi (oran 1:1) ile karıştırın ve numuneyi analiz etmeden önce karanlıkta 15 dakika inkübe edin.
- Numuneyi ~120.000 hücre/dak akış hızıyla akış sitometresine geçirin. Uygun ayarlarla ileri saçılan (FSC) ve yandan saçılan (SSC) ışığın yanı sıra DNA floresan boya floresan sinyalini (FL-1) elde edin.
- Hücre popülasyonundaki hücre boyutunun ve DNA içeriğinin dağılımını temsil etmek için FSC ve FL-1 hücre yoğunluğu histogramlarını çizin.