Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi Kullanılarak Bakterilerin Adaptif Evrimi

Abstract

Kaynak: Jian, X., ve diğerleri, Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi (MMC) Kullanılarak Otomatik Mikrobiyal Yetiştirme ve Uyarlanabilir Evrim. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, bakterilerin metanol toleransına doğru adaptif evrimini yönlendirmek için mikrobiyal bir mikro damlacık kültür sisteminin kullanımını göstermektedir. Sistem, tasarlanmış bakteri kültürlerini yüksek metanol stres ortamıyla karıştırarak ve bunları mikro damlacıklara bölerek, metanol stresi altında gelişmiş büyüme sergileyen mutantları seçer. Yinelemeli zenginleştirme döngüleri ve koloni izolasyonu yoluyla, metanole adapte olmuş bakteri suşları, daha fazla analiz veya uygulama için kültürlenir.

Protocol

MMC'de uyarlanabilir evrim

1. İlk bakteri çözeltisi için hazırlık
   1. MeSV2.2 için özel sıvı ortam ve katı plakaları hazırlamak ve 121 °C'de 15 dakika otoklav yapmak için ilgili standart yönetmeliklere uyun.
   2. MeSV2.2'yi katı plakayı (çap = 90 mm) kullanarak 37 °C sabit sıcaklıklı bir inkübatörde 72 saat boyunca yetiştirin. Daha sonra, bağımsız bir koloni seçin ve 50 mL'lik bir çalkalama şişesinde, çalkalayan bir inkübatörde (200 rpm) 37 °C'de 72 saat boyunca 10 mL özel sıvı ortam ile yetiştirin.
   3. Kültürlenmiş MeSV2.2 çözeltisini ortamla 0.1-0.2'lik bir OD_600'e seyreltin (toplam hacmin 10 mL'den az olmadığından emin olun) ve ilk bakteri çözeltisini elde etmek için çalkalama şişesinde 5 saat yetiştirmeye devam edin.
      NOT: MeSV2.2, metanol esansiyel bir E. coli türüdür. Özel sıvı ortam, MeSV2.2 için güçlü bir stres olan 500 mmol/L metanol içerir, bu da çok yavaş büyüme sonucunu doğurur..
2. MMC'yi başlatın.
3. Biri ilk bakteri çözeltisi için, diğeri ise taze ortam için olmak üzere iki sterilize reaktif şişesini çıkarın. İlk bakteri solüsyonunu (5 mL), taze ortamı (12-15 mL) ve MMC yağını reaktif şişelerine enjekte edin.
   NOT: Uyarlanabilir evrim, birden fazla alt ekimi içeren uzun vadeli bir süreç olduğundan, MMC'de mümkün olduğunca fazla taze ortam depolayın. Deney sırasında ortam yenilenemez.
4. İki reaktif şişesini MMC'ye takın. Birini C2 ve O2 konektörü arasına ilk bakteri çözeltisi için, diğerini ise C4 ve O4 konektörü arasındaki taze ortam için takın.
5. Uyarlanabilir evrimin işlevini seçmek için ALE'ye tıklayın (Şekil 1B). Parametre ayar arayüzünde, OD Algılama anahtarını açın.

6. Sayıyı 50, Dalga Boyu'nu 600 nm, Konsantrasyon'u %0, Türü Zaman, Parametre'yi 30 saat ve Tekrarları 99 olarak ayarlayın. Damlacık üretimini başlatmak için Başlat'a tıklayın. Yaklaşık 25 dakika sürecektir.
   NOT: Burada "Konsantrasyon", adaptif evrim için kimyasal faktörlerin maksimum konsantrasyonunu ifade eder. Farklı damlacıklar için, MMC'de farklı büyüme koşulları sağlamak amacıyla farklı konsantrasyonlarda kimyasal faktörlerin eklenmesi gerçekleştirilebilir. Aşağıdaki denklemi kullanarak eklenen konsantrasyonları hesaplayın:

   

   Burada "C" , damlacıklara eklenen kimyasal faktörlerin konsantrasyonunu ifade eder; "a", C4 ve O4 konektörü arasındaki reaktif şişelerindeki kimyasal faktörlerin konsantrasyonunu ifade eder; "b", C6 ve O6 konektörü arasındaki reaktif şişelerindeki kimyasal faktörlerin konsantrasyonunu ifade eder; ve "i" mevcut konsantrasyonu ifade eder. MMC'de sekiz konsantrasyon mevcuttur. Buradaki kimyasal faktör tek bir konsantrasyona (500 mmol/L metanol) sahip olduğundan ve ortamın bileşenlerinden biri olduğundan, buraya kimyasal faktörü içeren yalnızca bir reaktif şişesi takılır ve Konsantrasyon %0 olarak ayarlanır. Tip, üç türe ayrılan alt yetiştirme modunu ifade eder: zaman modu, OD değeri modu ve floresan modu. İlki, damlacıkları sabit bir süre için yetiştirmek ve ardından alt yetiştirmek anlamına gelirken, son ikisi, damlacıkları önceden tanımlanmış bir OD değerine/floresan yoğunluğuna yetiştirmek ve ardından alt yetiştirmek anlamına gelir. Parametre, bir alt yetiştirme modu seçerken gerekli olan ilgili parametreyi ifade eder. Tekrarlar, alt yetiştirme sayısını ifade eder.

7. C2 ve O2 konektörleri arasına yerleştirilen reaktif şişesini çıkarın.
8. Her alt yetiştirme döneminde damlacıkların maksimum OD değerlerinin önemli ölçüde artıp artmadığını gözlemleyin. Artış meydana gelirse ve deney gereksinimlerini karşılıyorsa, OD verilerini dışa aktarmak için Veri Dışa Aktarma düğmesine tıklayın.
   NOT: Burada alt yetiştirme süresi Parametreye bağlıdır. Örneğin, Tür Zaman ve Parametre 30 saat olarak ayarlandığında, alt yetiştirme süresi 30 saattir. Her alt yetiştirme döneminde, damlacıkların maksimum OD değerleri vardır. Adaptif evrimin, maksimum OD değerlerinin artmasıyla deney gereksinimlerini karşılayıp karşılamadığını tahmin edin (Artış, örneğin 'den fazla artan suşun gerçek yetiştirme sürecine bağlıdır). DİKKAT: Depolanan taze ortamın tükenip bitmediğine dikkat edin. Ortam tükendikten sonra bile önemli bir artış meydana gelmediyse, daha iyi büyüyen damlacıkları çıkarın ve yeni bir adaptif evrim turu gerçekleştirin.
9. Hedef damlacıkları MMC'den çıkarın.
   1. Damlacık çıkarma işlevini seçmek için Tarama düğmesine tıklayın (Şekil 1C). Topla seçeneğini seçin, hedef damlacık sayısına tıklayın ve ardından Tamam'a tıklayın.
      NOT: Damlacık taraması "Topla", "At" ve "Tohum çözeltisini çıkar"ı içerir. "Ekstrakt tohum çözeltisi", alt yetiştirme işleminden sonra kalan damlacıkların toplanması anlamına gelir.
   2. Açılır pencerenin "Lütfen CF hızlı konektörünü çıkarın ve EP tüpüne yerleştirin" uyarısını vermesini bekleyin. CF hızlı konektörü, yazılım istemine göre toplamak için mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve ardından Tamam'a tıklayın (Şekil 2D).
   3. 1-2 dakika sonra, yazılım arayüzünde "Lütfen konektörü geri takın ve bittiyse Tamam'a tıklayın" uyarısında bulunan yeni bir pencere açılacaktır. Ardından, CF hızlı konektörünü geri takın ve MMC'nin çalışmaya devam etmesi için Tamam'a tıklayın (Şekil 2D).
      NOT: Tüm hedef damlacıklar toplandıktan sonra, MMC kalan damlacıkları yetiştirmeye devam edecektir. Yetiştirme gerekli değilse, işlemi doğrudan sonlandırmak için Durdur'a tıklayın.
   4. Damlacığı 2,5 μL'lik bir pipet kullanarak çıkarın, 90 mm'lik agaroz plakasına bırakın ve kenar uzunluğu 3 cm olan üçgen bir cam yayma çubuğu ile eşit şekilde yayın. Ardından, 37 °C sabit sıcaklıktaki bir inkübatörde 72 saat boyunca yetiştirin.
   5. 3-5 bağımsız koloni seçin ve bunları 50 mL'lik çalkalama şişelerinde 10 mL taze ortamla birlikte 37 °C'de 37-72 saat çalkalayan bir inkübatörde (200 rpm) ayrı ayrı yetiştirin. Kültürlenmiş bakteri çözeltisini sonraki deneyler için gliserol tüpünde saklamak için ilgili standart düzenlemeleri izleyin.

Results

Şekil 1: MMC'nin işletim yazılımı arayüzü. (A) Yazılımın ana arayüzü. (1) Çalışma odasındaki sıcaklık. (2) Damlacık tanımanın fotoelektrik sinyal değeri. Damlacık geçtiğinde sinyal değeri yüksektir (>2 V). Yağ geçtiğ...

Materials