Bakteriyel Hücrelerle Mikrofluidik Plakanın Hazırlanması

Özet

Kaynak: Sutlief, A. L. ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa üzerindeki kayma stresinin otomatik yüksek verimli mikrofluidik sistem kullanılarak canlı hücre analizi. J. Vis. Exp. (2019).

Bu video, bakteriyel kültürlerde kesme stresi çalışmaları için mikrofluidik bir plakanın hazırlanmasını göstermektedir. Kanallar ortamla astarlandıktan sonra, bakteri hücreleri deneysel kanala getirilir ve bağlanmak üzere kuluçka yapılır. Kalıntı ortam ve kültür çıkarılarak sistem sonraki kesme stresi deneylerine hazırlanır.

Protokol

1. Medya Hazırlığı

1. %0,25 glikoz içeren minimal ortam (MM) hazırlayın. %0,25 glukozlu 1 L MM yapmak için, 200 mL steril M9 tuz çözeltisi, 2 mL steril 1 M magnezyum sülfat (MgSO₄), 100 μL steril 1 M kalsiyum klorür (CaCl₂) ve 12,5 mL steril %20 (w/v) glikoz ile suya (dH₂O) son hacim 1 L olarak eklenin.
2. Gerekli medyayı steril tekniklerle steril bir şişeye aktarmak. Kullanılan kanal sayısına göre gereken miktarı hazırlayın. Genellikle, her kanal primasyon için 200 μL, tohumlama için 300 μL ve 24 saatlik deney için 1300 μL gerektirir.
3. Şişeyi deneysel sıcaklıkta bir kuluçka veya su banyosuna yerleştirin. Mikrokanallarda baloncukların oluşmaması için ortam kullanılmadan önce deney sıcaklığında olmalıdır.

2. Geliştirilmiş yeşil floresan protein (PA01-EGFP) ifade eden Pseudomonas aeruginosa suşunun PA01'in gece boyunca ve deneysel kültürünün hazırlanması.

1. 15 mL deneysel ortamı steril bir yan silah şişesine yerleştirin ve PA01-EGFP ile çizgilenmiş bir agar plakasından bir veya iki koloni ile aşılayın. Kültürü 12-16 saat boyunca kuluçka makinesi/shaker masasında 37 °C ve 180-220 rpm'de genişletin.
2. Gece kültürünün_{OD 600'ünü} ölç. OD₆₀₀ 0.80'in üzerinde olduğunda, gece kültürünü taze MM ile nihai OD 0.8'e kadar seyreltirin. Deneysel kültürü mikrofluidik kanalların tohumlanması için ihtiyaç duyulana kadar 37 °C sıcaklıkta bir kuluçka veya su banyosuna yerleştirin. Tohumlamadan hemen önce OD_600'ü tekrar kontrol edin ve hedef_{OD 600'den}, bu durumda 0.8'den önemli ölçüde değişmediğinden emin olun.

3. Ekipman Başlatma

1. Sistem istasyonunu, Şekil 1'deki kuruluma benzer şekilde kullanıcı kılavuzuna göre kurun. Enstrümanın yazılıma bağlanmasında hata yaşanmasını önlemek için, enstrümanı aşağıdaki sırayla açın:
   PC İş İstasyonu
   Floresans Modülü. Floresan deklanşörünün AÇIK olduğundan emin olun (deklanşör düğmesinin mavi ışığı açık)
   Donanım Kontrolörleri
   Görüntüleme sistemi Kontrolörü ( bkz. Materyal Tablosu)
   CCD Kamera
   Görüntüleme İstasyonu (Mikroskop)
   NOT: Isıtılan plakanın sıcaklığı istenen deneysel sıcaklığa ayarlanmalıdır.
2. Kontrol uygulamasını başlatın ve plakanın yanındaki etikette bulunan plaka numarasını girin.
   NOT: Kontrol uygulaması başladıktan sonra, mikroskop/görüntüleme yazılımını kontrol eden yazılım ve pompa ile kuyu plakası arayüzünü kontrol eden kontrol modülü için olmak üzere iki ayrı uygulama penceresi olacak.

4. Mikrofluidik Plakanın Astarlanması ve Tohumlanması

NOT: Astarlama, tohumlanma, bakteri bağlanması ve büyüme Şekil 2'de gösterilmiştir.

1. 48 kuyruklu mikrofluidik plakayı ambalajdan çıkarın, tabağın altındaki cam yüzeye dokunmamaya dikkat edin. Plakanın altındaki cam slaytı lens mendilesi, tüy içermeyen bir bez veya az tüy içeren bir mendil ile iyice temizleyin.
2. Mikrofluidik kanalları astarlamak için, 200 μL 37 °C MM sıcaklığında pipetle çıkış yuvasına kabarcık oluşmamaya dikkat edin. Plakayı plaka aşamasına yerleştirin ve arayüzü etanol ile silerek kurumasını sağlayın, ardından plaka aşamasına mühürleyin.
3. Kontrol modülünde Manuel Modda, Fluid olarak
   luria-bertani (LB) 37 °C'de ve maksimum kesme 5.00 dyne/^cm2'de olur. Çıkış kuyruklarına tıklayarak çıkıştan giriş kuyusuna akışı aktive edin ve kanalları astarlayın. 5 dakikalık astarlamadan sonra, tohumlama için akışı durdurun. Plakayı sahneden dikkatlice çıkarın ve çıkıştan pipet kalıntısı maddesini çıkarın, ancak mikrofluidik kanallara giden iç çemberden hiçbir maddeyi çıkarmayın.
4. Deneysel kanalları tohumlamak için önce 300 μL MM giriş kuyusuna pipet yapılır, ardından 300 μL bakteri kültürünü çıkış kuyusuna pipet edilir. Plakayı tekrar plaka aşamasına yerleştirin, arayüzü tabağa koymadan önce sildiğinizden emin olun.
5. Kontrol Modülünde, plaka aşamasını mikroskop aşamasına yerleştirdikten sonra canlı kamera görüntüsü kullanılarak tek bir kanala odaklanın. Canlı besleme ile görsel olarak izlenirken, hücrelerin deneysel kanala girmesini sağlamak için yaklaşık 2-4 saniye boyunca 1.00-2.00 dyne/^{cm 2} aralığında akışı sürdürün, ancak serpantin kanallara girmesin. Plakayı hücre bağlanması için sıcaklık kontrollü aşamada 1 saat bırakın. 1 saatlik kuluçka sırasında, otomatik çalıştırma için Kontrol Modülü ve montaj yazılımı kurulabilir.
   NOT: Tohumlama süresi ortam ve organizmaya göre değişir, bu yüzden canlı besleme tarafından yakından izlenmelidir, optimize edilip genel bir zaman aralığı olarak kullanılana kadar. Plaka boyunca tohumlama değişiklik gösterebilir, bu da belirli kanal sütunlarına tam tohumlama için daha fazla zaman gerektirir.
6. Bağlantı süresinden sonra, plakayı aşamadan nazikçe çıkarın ve önce çıkıştaki bakterileri pipetleyin, böylece kanalı rahatsız etmeyin. Yeni bir pipet ucu ile giriş yuvalarından ortamı çıkarın.

Sonuçlar

Şekil 1: Mikrofluidik Sistemin Bireysel Bileşenleri. Bireysel bileşenler soldan sağa sıralanmıştır: 1. CCD kamera, 2. Otomatik Aşama, Otomatik Floresan Modülü ve Otomatik Odak Modülü ile Yüksek Çözünürlüklü Ters Mikroskop, 3. Plaka Aşaması,...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amonyum klorür, ACS	VWR	BDH9208-500G	Minimal medya kompozisyonunun bir parçası
BioFlux 1000 48 Kuyu Düşük Kesme Plakası	Fluxion Biyobilimleri	910-0047
BioFlux 1000Z Mikrofluidik Görüntüleme Sistemi	Fluxion Biyobilimleri	BF 1000Z
Kalsiyum klorür dihidrid, ACD Sınıfı	VWR	97061-904	Minimal medya kompozisyonunun bir parçası
Dekstroz, Ansutiz, ACS	VWR	BDH9230-500G	Minimal medya kompozisyonunun bir parçası
Magnezyum Sülfat ACS Sınıfı	VWR	EM-MX0070-1	Minimal medya kompozisyonunun bir parçası
Potasyum Fosfat Monobazik, ACS Sınıfı	VWR	BDH9268-500G	Minimal medya kompozisyonunun bir parçası
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	Bu çalışmada GFP modifikasyonlu Pseudomonas aeurinosa bakteri suşu PA01 kullanılmıştır.
Sodyum Klorür, ACS	VWR	BDH9286-500G	Minimal medya kompozisyonunun bir parçası
Sodyum fosfat, monobazik, susuz ve reaktif kalitesinde	VWR	97061-942	Minimal medya kompozisyonunun bir parçası