Yöntem makalesi

Rekombinant RBD tabanlı SARS Aşılar için Protokol: Protein hazırlanması, Hayvan Aşılama ve Nötralizasyon Algılama

DOI:

10.3791/2444

⸱

2 Mayıs 2011

 ,  ,  , 
1Lindsley F. Kimball Research Institute, New York Blood Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, SARS karşı rekombinant reseptör-bağlayıcı etki alanı (RBD) tabanlı altbirim aşılar eğitim için genel bir yordam açıklanır. RBD 293T hücrelerinin protein, RBD ve fare sera kurulmuş bir SARS pseudovirus nötralizasyon tayini ile nötralizasyonu aktivitesi tespit ile farelerin bağışıklık transfeksiyon ve anlatım yöntemleri içerir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Güvenlik profili ve enfeksiyonlara karşı güçlü bir bağışıklık yanıtları uyardığı yeteneği dayanarak, alt ünite aşıları 1-3 patojenleri geniş bir yelpazede aday olarak kullanılmaktadır. Memeli hücresi sistemi, böylece düzgün katlanmış ve glikozile proteinleri oluşturan, post-translasyonel değiştirme yeteneğine sahip olduğu için, memeli hücrelerinde ifade rekombinant proteinlerin yüksek antijenik ve immünojenite 4-6 korumak için en büyük potansiyel göstermiştir.

SARS, 2004 yılından bu yana hiçbir yeni vaka bildirilmiş olmasına karşın, gelecekte salgınları sürekli bir tehdit ve bu nedenle, SARS-CoV karşı aşıların geliştirilmesi, ihtiyatlı bir önleyici adımdır ve yapılmalıdır. SARS-CoV S protein RBD reseptör bağlayıcı ve virüs enfeksiyonu 7-9 karşı spesifik nötralizan antikorlar indüksiyon önemli rol oynar. Bu nedenle bu protokol, RBD tabanlı altbirim SARS karşı aşı geliştirmek için yeni yöntemler açıklanmaktadır. Kısaca, rekombinant RBD protein (rRBD), uygun konformasyon ve yüksek immünojenite 6 ile doğru katlanmış bir protein elde etmek için, memeli 293T hücrelerinin kültür süpernatant ifade edildi. Hücrelere rekombinant plazmid kodlama RBD transfeksiyon sonra, bazı değişikliklerle birlikte kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi 6,10 kullanılarak gerçekleştirildi . Lipid transfeksiyon yöntemi 11,12 ile karşılaştırıldığında, bu değiştirilmiş kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi işlemek için ucuz, kolay ve uygun boyutu ve şekli ile transfeksiyon kompleksi 13,14 oluşur kez yüksek etkinliğini ulaşmak için bir potansiyele sahiptir. Son olarak, SARS pseudovirus nötralizasyon tayini protokol tanıttı ve sera rRBD protein ile aşılanan farelerin nötralize aktivite tespit etmek için kullanılır oldu. Bu testte, nispeten güvenli, bulaşıcı bir SARS-CoV dahil değildir ve bir biyogüvenlik-3 laboratuvar 15 gereksinimi olmadan yapılabilir .

Burada açıklanan protokol aynı zamanda örneğin, HIV, respiratuar sinsisyal virüs (RSV), Ebola virüsü, grip virüsü gibi, Nipah ve Handra virüsler, tasarım ve diğer virüslere karşı rekombinant altbirim aşıları sınıf I füzyon proteinleri ile çalışma kullanılabilir. Buna ek olarak tüm bu virüslerin pseudovirus üreten ve daha sonra pseudovirus nötralizasyon tayini kurulması için yöntemler uygulanabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rekombinant SARS-CoV RBD Protein Hazırlık

  1. Kalsiyum fosfat transfeksiyon reaktif hazırlayın
    1. 2X HBS tampon hazırlanması: 16 g NaCl, 0,4 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O ve Hepes 13,0 g birlikte karıştırın. PH 7.00 ayarlayın ve toplam hacmi 1000 ml distile su getirmek. Sterilizasyon, kısım için çözüm filtreleme ve -20 ° C'de saklayın sonra
      İpucu: pH değerinin herhangi bir değişiklik transfeksiyon sonuçlarını etkileyebilir. Böylece, etrafında birkaç pH değerleri 7.00 (örneğin, 6.99, 7.00, veya 7.01) test etmek ve aşağıda tanıtılan yöntem kullanarak transfeksiyon için en uygun olanı bulmak için tavsiye edilir.
    2. 2.5 M CaCl 2 hazırlık: 73.5 g CaCl 2 * 2H 2 O son hacim 200 mL distile su ekleyin. Filtre -20 ° C'de çözüm ve mağaza
  2. Rekombinant plazmid transfeksiyon ve protein saflaştırılması
    1. Transfeksiyon 24 saat önce confluency 293T hücrelerin% 50-70 Böl. 40 ml DMEM FBS ve% 1 penisilin / Streptomisin (P / S) 37% 10 ısı ile inaktive edilmiş (HI) içeren ° C,% 5 CO 2 T-175 cm 2 doku kültürü şişeler hücrelerin büyütün .
    2. Tüm transfeksiyon ayıraçları, önce oda sıcaklığına kadar transfeksiyon getirilmelidir. Bu reaktifler 2X HBS, 2.5M CaCl 2 dih 2 O, ve rRBD plazmid 6 içerir.
      İpucu: protein ekspresyonu kültür süpernatant ifade rekombinant proteinlerin salgılanmasını sağlamak için bir sinyal peptid içermelidir son rekombinant plazmid inşa. 6x Onun etiketi için kolay arıtma ifade protein C-terminal eklenebilir.
    3. 50 ml (A) ve 15 ml (B) BD Falcon tüp hazırlanması ve Tablo 1'de gösterildiği gibi tüplere reaktifler eklemek. Tüp B tüp A. 2X HBS tampon, 2.5M CaCl 2 eklemek ve plazmid rRBD ve dih 2 O. gereksinimi ses getirmek
      A. Bir T-175 cm 2 doku kültürü balonuna (4000 mcL / şişesi): rRBD ifade hazırlanmak
      Tüp A Tüp B
      2X HBS 2000 mcL 2.5M CaCl 2 200 mcL
      rRBD plazmid DNA 40 mikrogram
      Dih 2 O 2000 mcL
      B. Bir 100-mm petri (1000 mcL / yemek): SARS pseudovirus üretim için hazırlamak
      Tüp A Tüp B
      2X HBS 500 mcL 2.5M CaCl 2 50 mcL
      SARS-CoV S plazmid DNA 5 mikrogram
      (PNL4 3.luc.RE) HIV-1 plazmid 5 mikrogram
      Dih 2 O 500 mcL
      Tablo 1: Transfeksiyon karışım hazırlama ve birimler
      Tablo 1'de belirtilen miktarlar bir transfeksiyon ünitesi için. Daha fazla matara veya yemekler transfeksiyon için kullanılırsa, buna göre hacimleri ayarlayabilirsiniz.
    4. Bir girdap sabit ve yumuşak bir karıştırma korurken, tüp damla damla bir şekilde bir tüp B DNA kalsiyum çözüm ekleyin. Karışımı 20-30 dakika oda sıcaklığında bekletin. Başarılı kalsiyum fosfat transfeksiyon için anahtar boyutu ve şekli, oluşan çökelti bağlıdır. Böylece, karışımın bir sonucu olarak, transfeksiyon etkinliğini arttırmak, bu gereksinimi karşılamak için sürekli ve yavaş yavaş vortekslenmiş ve olmalıdır.
    5. 293T hücreleri (4000 mcL / balon) içine damla damla ve hatta bir şekilde karışımı ekleyin. 37 ° inkübatör Kültür hücreleri ° C,% 5 CO 2 .
    6. Taze serum OPTI-MEM İndirgenmiş-Serum Orta (50 ml / balon) 8-10 saat sonrası transfeksiyon ile kültür ortamı değiştirin. Kültür hücreleri aynı durumun iki gün daha devam edin.
    7. Süpernatant içeren ifade rRBD protein 72 saat sonrası transfeksiyon toplayın. Hücre enkaz kaldırmak için 6000 rpm'de 15 dakika santrifüjleyin. 4 ° C gecede toplanan süpernatant ve mağaza proteaz inhibitörü kokteyl ekleyin.
    8. Ertesi gün, Ni-NTA Superflow aşağıdaki üreticinin talimatlarına kullanarak kültür süpernatant rRBD rekombinant protein arındırmak.
    9. Amicon Ultra -15 konsantrasyon tüpler kullanılarak proteinin saflaştırılmış konsantre ol. Protein konsantrasyonuPBS toplama tüplerine ekleyin ve imidazol elüsyon tampon kaldırmak için tekrar santrifüj. -80 ° C kullanana kadar az protein saflaştırılmış protein konsantrasyonu ve mağaza hesaplayın.

2. Fare Bağışıklama ve Örnek Toplama

  1. 40-45 Pre-sıcak Sigma adjuvan sistemi (SAS) ° C ile üreticinin talimatlarına göre. Flakon başına 1 ml PBS ekleyin ve iyice karıştırın.
  2. Tablo 2'de protokole göre protein-adjuvan emülsiyon hazırlayın. Pipet, 1.5 mL tüp içine rRBD protein hesaplanır. SAS adjuvan eşit hacim ve emülsiyon oluşturmak için 2-3 dakika boyunca kuvvetlice vorteks tüp ekleyin.
    İpucu: Tablo 2'de belirtilen miktarlar bir fare. Hacimleri kullanılan gerçek fare numaralarına göre ayarlayın. Her grup için, her aşı için gerekli protein ve adjuvan karıştırın. Doğruluğunu sağlamak için aşılama için her zaman ekstra bir örnek hazırlamak.
    Grup 1 st aşı
    (200 mcL / fare)     		2 nci aşı
    (200 mcL / fare)     		3 üncü aşı
    (200 mcL / fare)
    rRBD protein PBS içinde 20 mg protein
    (100 mcL) + 100 mcL SAS     		PBS içinde 10 mg protein (100 mcL) + 100 mcL SAS PBS içinde 10 mg protein (100 mcL) + 100 mcL SAS
    PBS kontrolü 100 mcL PBS +
    100 mcL SAS     		100 mcL PBS +
    100 mcL SAS     		100 mcL PBS +
    100 mcL SAS
    Tablo 2: Fare bağışıklama protokolü
  3. Subkutan prime-bağışıklık kadın BALB / c farelerde (eski 4-6 hafta, 5 fare / grup) ve rRBD ve SAS ile iki kat artırmak gibi Tablo 2'de gösterilmiştir. PBS grup kontrol olarak kullanın. Genellikle seçilen subkutan enjeksiyonlar için site, kürek kemikleri arasındaki gevşek deri. Alternatif olarak, ventral karın enjekte etmek kolaydır, çünkü yaygın olarak kullanılır, ve herhangi bir sızıntı enjeksiyon siteleri gözlemlemek olabilir. Tekrarlanan doz aşı kullanıldığında, potansiyel yerel deri reaksiyonları önlemek, çeşitli enjeksiyon siteleri seçmek kolaydır.
  4. Her aşıdan sonra aşılama ve 10 gün önce 56 ° C'de 30 dakika için tamamlayıcı inaktive anestezi ile retro-orbital, ısı ve sera ile fareler Bleed. Kullanana kadar -20 ° C'de saklayın fare sera.

3. Nötralizasyon Algılama kullanarak Pseudovirus Nötralizasyon Testi

  1. SARS pseudovirus hazırlayın
    1. Transfeksiyon önce 100 mm doku kültürü petri kaplarına (2x10 6 hücre / yemek) 16 saat 293T hücreler Split, ve yukarıdaki gibi hücreleri büyümek.
    2. Tablo 1'de gösterildiği gibi transfeksiyon ayıraçları hazırlayın. Co-transfect plazmid kodlama SARS-CoV S protein ve plazmid kodlama Env kusurlu, lusiferaz-HIV-1 genom ifade (pNL4 3.luc.RE) kalsiyum fosfat transfeksiyon reaktifi kullanılarak.
    3. 10 ml taze DMEM% 10 FBS ve% 1 P / S 8-10 saat sonrası transfeksiyon içeren orta değiştirin. Süpernatant içeren SARS pseudovirus 72 saat sonrası transfeksiyon toplayın.
    4. 0.45 mikron filtre ile filtre pseudovirus. Kısım ve mağaza -80 ° C kullanana kadar.
  2. SARS pseudovirus nötralizasyon tayini
    1. 16 saat önce 96-iyi doku kültürü plakaları 4 cells/100 mcL / 10 SARS-CoV reseptörü ACE2 (ACE2/293T) ifade 293T hücreleri enfeksiyon Bölünmüş.
    2. ACE2/293T hücrelerde virüs titresi tespit etmek için 2 kat SARS pseudovirus sulandırınız.
    3. Seri 96-iyi doku kültürü plakaları fare sera sulandırmak ve titre SARS pseudovirus eşit miktarda ekleyin. 1 saat 37 ° C'de plakaları Preincubate
    4. ACE2/293T hücreleri inkübasyondan sonra, sera pseudovirus karışımı 100 mcL ekleyin ve 37 ° hücreler büyümeye devam ° C,% 5 CO 2 . Taze DMEM 24 saat sonra ekleyin.
    5. Tamamen kültür süpernatantlar plakaları 72 saat enfeksiyon sonrası çıkarın. 1X lusiferaz hücre kültürü reaktifi (60 mcL / iyi) ekleyin ve oda sıcaklığında 1-2 saat süreyle sabit plaka titreme ile hücre parçalama teşvik.
    6. Luminometre tabak içine transfer hücre ilginçtir (50 mcL / iyi) (Microfluor 96-kuyucuğu). Lusiferaz tahlil sistemi dahil lusiferaz substrat (50 mcL / kuyu) ekleyin ve Ultra 384 luminometre göreli lusiferaz aktivitesini algılar.
    7. % 50 nötralizan antikor titresi (NT 50) 6 olarak SARS pseudovirus nötralizasyon titresi ve mevcut hesaplayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre yoğunluğu kalsiyum fosfat tabanlı transfeksiyon etkinliğini etkileyen önemli bir faktördür. Deneyimlerimize göre,% 70 daha az hücrelerin confluency en iyi sonuçları getiriyor. Böylece, transfeksiyon verimliliğini artırmak için, hücre yoğunluğu confluency, yaklaşık% 50-70 tutulması tavsiye edilir. Kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntem genellikle lipid transfeksiyon 16 gibi diğer transfeksiyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha az etkili olduğu düşünülmektedir. Ancak, bu protokolde, böylece Transfeksiyonu verimliliği artırmak, sürekli ve yavaş bir girdap transfeksiyon çözüm karıştırma uygun boyutu ve şekli ile bir çökelti oluşumunu sağlar böylece değiştirilmiş bir kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi kullandı.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (RO1 AI68002) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
NaClSigma-AldrichS7653
Na2HPO4*7H2OSigma-AldrichS2429
HEPESSigma-AldrichH3375
CaCl2*2H2OSigma-AldrichC5080
DMEMInvitrogen12430
HI FBSInvitrogen10438
Penisilin/StreptomisinInvitrogen15140
OPTI-MEM I BesiyeriInvitrogen31985
Proteaz inhibitör kokteyliRoche Group11836170001
Ni-NTA SuperflowQiagen30450
Sigma adjuvan sistemiSigma-AldrichS6322
Lusiferaz assay sistemiPromega Corp.E1501
Lusiferaz hücre kültürü lizis reaktifi (5X)Promega Corp.E1531
Amicon Ultra - 15EMD MilliporeUFC901024
Microfluor 96 kuyucuklu plakalarThermo Fisher Scientific, Inc.7905
Ultra 384 lüminometreTecan Group Ltd.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).
  2. Tait, A., Hall, F. R. Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines. Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).
  3. Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270. Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).
  4. Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
  5. Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).
  6. Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity. Virology. 393, 144-150 (2009).
  7. Ambrosino, D. M. Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor. J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).
  8. Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 426, 450-454 (2003).
  9. He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).
  10. Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection. Gene. 270, 61-68 (2001).
  11. Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents. BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).
  12. Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
  13. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
  14. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  15. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326, 140-149 (2004).
  16. Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

SARS A sRBD ProteiniKalsiyum Fosfat TransfeksiyonuPs dovir s N tralizasyon DeneyiMemeli H cresi EkspresyonuProtein Safla t rmaFare mm nizasyonuN tralize Edici Antikor TitresiACE2 Resept rL siferaz Deteksiyonu

İlgili makaleler