Bu video post-mortem gözünde, insan vitreus vücudunun çeşitli yarı saydam yapıların ayrılması ve diseksiyon için etkili bir teknik gösterir.
Yöntem makalesi
Proteomik Analizi İnsan Vitreus Gövde Elemanları diseksiyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Vitreus, göz ve retina üzerinde yer içini doldurur optik açık bir kollajenöz ekstrasellüler matriks, vitreus altyapılar ve retina arasında 1,2 Anormal etkileşimleri retina yırtığı ve dekolmanı, maküler pucker, makula deliği dahil olmak üzere birçok vitreoretinal hastalıkların , altında yaşa bağlı makula dejenerasyonu, vitreomaküler çekiş, proliferatif vitreoretinopati, proliferatif diyabetik retinopati ve miras Vitreoretinopatilerde. 1,2 vitreus altyapılardan moleküler kompozisyonu bilinmemektedir. Vitreus sınırlı cerrahi erişim ile şeffaf olduğundan, moleküler düzeyde altyapılar incelemek için zor olmuştur. Proteomik ve biyokimyasal analiz için ayrı ve bu dokuları korumak için bir yöntem geliştirdi. Bu deneysel video diseksiyon tekniği, vitreus tabanı, anterior hyaloid, vitreus çekirdek ve postmortem insan gözü vitreus korteks izole etmek için nasıl gösterir. Her vitreus bileşeni tek boyutlu SDS-PAGE analizleri bizim diseksiyon tekniği, insan vitreus vücudunun her bir altyapı karşılık gelen dört benzersiz protein profilleri yol açtığını gösterdi. Farklı bölümlere proteinlerin belirlenmesi, aday molekülleri çeşitli vitreoretinal hastalıkların altında yatan ortaya koyacaktır.
Protokol
1. Ön Segment Diseksiyon.
- (Şekil 1) 15 ° bir bıçak kullanarak ön odasına limbus bir kesi yaparak kornea kaldırılır. Sonra bir bıçak, kavisli kornea-skleral makas, ön kamara eklenir. Dairesel keser limbus sadece ön kornea yapılır.
- 0.12 Colibri forseps ve Westcott'a makas, iris, siliyer cisim dairesel ön kesmek için kullanılır.
- Lens çekirdeği 0,12 Colibri forseps veya 15 ° bıçağı (supersharp) ve forseps ile korteks ve kapsül ile kaldırılır.
2. Vitreus Çekirdek Aspirasyon.
- 5 cc şırınga, 23-gauge iğne sokulur orta vitreus (Şekil 1).
- Yaklaşık 1 ml veya daha fazla vitreus çekirdek nazikçe aspire edilir.
- Örnek sonra, bir mikrofuge'de tüp içinde ve daha sonra sıvı azot içine yerleştirilir.
3. Anterior Hyaloid Diseksiyon.
- Anterior hyaloid bir kaz boynu mikroskop ışık ışık ayarlayarak yarı saydam bir halkası olarak görülüyor. Önceki vitreus çekirdek aspirasyonu, diğer yapılardan daha kolay tespit edilebilmesi için ön hyaloid ayırır.
- Colibri veya giyinme forseps ile siliyer cisim elastik doku sayfasını dikkatlice çekti ve Vannas makas ile kesilir. Bu manevra tekrarlanır.
- Örnek sonra, bir mikrofuge'de tüp içinde ve daha sonra sıvı azot içine yerleştirilir.
4. Vitreus Base Diseksiyon.
- Göz fincan stabilize 0.12 forseps kullanma, Westcott makas, siliyer cisim, optik sinir başı doğru dört eşit aralıklı stres giderici kesikler yaparak "çiçek" göz için kullanılır.
- Siliyer cisim (Şekil 2) pars Plicata Westcott makas kullanarak kadranın her kaldırılır.
- Vitreus tabanı, pars plana ve retina (Şekil 2) üzerinde forseps ile ora serrata her iki tarafta kavradı.
- Vitreus tabanı sürekli çekiş forseps uygulanır. Eksize olarak Sıralı Westcott makas ile kesme "inci string" görünümü ile yarı saydam bir doku ayıklar.
- Örnek sonra, bir mikrofuge'de tüp içinde ve daha sonra sıvı azot içine yerleştirilir.
5. Vitreus Cortex Kaldırma.
- Pars plana ora serrata (Şekil 2) posterior yaklaşık 3 mm broşürün keserek Westcott makas ile kadranın her eksize edilir.
- Vitreus korteks doku broşürler arasında, yarı saydam bir film olarak görüntülenmiştir.
- Elastik film ya 0.12 forseps ile kavradı veya Weck-Cel cerrahi sünger bağlılık tarafından düzenlenen. Vitreus korteksi sonra retinanın uzak çekti ve Westcott makas (Şekil 1) ile birlikte çıkarıldı.
- Örnek bir mikrofuge'de tüp ve daha sonra sıvı azot içine yerleştirilir. Tüm numuneler deney için kullanılan -80 ° C kadar saklanır.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Doku örnekleri özel deneyler için çok çeşitli yöntemler tarafından işlenebilir. Bizim durumumuzda, örnekler, SDS-PAGE (Şekil 3) protein analizi için sunulmuştur.
Şekil 1. Insan gözünün kesitsel görünümü vitreus vücudun farklı altyapılardan resmeden en ön vitreus ön hyaloid denilen ince bir kollajen tabakası. Vitreus çekirdek vitreus vücudun tüm merkez bölgesi oluşur. Vitreus bu bölümü yeterli viskoz forseps ile kavranabilir ve yatan siliyer cisim ve retina sıkıca bağlı olan vitreus tabanı, aksine daha sulu. Vitreus çekirdek yakınınızda vitreus korteks denilen çok ince bir kollajen kabuk.
Şekil 2. Vitreus tabanı anatomisi. Vitreus tabanı, siliyer cisim ve retina ayıran hat, ora serrata (beyaz oklar), yanında bulunan vitreus yarı saydam bir altyapı . Vitreus tabanının ön sınır siliyer cisim pars plana (beyaz çizgi) boyunca uzanır. Vitreus tabanının arka sınır ora serrata (beyaz çizgi) posterior 2-3 mm uzanır. Tüketim için vitreus tabanı, forseps doku kavramak ve altta yatan siliyer cisim ve retina uzağa çekmek için kullanılır. Yükselmiş, sonra Westcott makas tabanı boyunca kesmek için kullanılır.
Şekil 3. Tek boyutlu Vitreus Gövde Elemanları SDS-PAGE ön hyaloid total protein konsantrasyonları, vitreus tabanı, vitreous çekirdek, ve vitreus korteksi sırasıyla 11.24, 20.1, 16.61, 14.24 mg / ml idi. Jel elektroforezi 45 dakika için 200 kV Flamingo (Bio-Rad) ile boyanmış ve bir VersaDoc Görüntüleme sistemi (Bio-Rad) kullanılarak görüntülendi. Farklı dokular için profilleri, farklı yerelleştirilmiş proteinler gösteren korunmuş (yıldız) veya protein çapraz kirlenmesine neden olan, aynı zamanda benzersiz bantları gösteren, benzer pek çok bantları göstermektedir.
Tartışma
Vitreus tabanı, çekirdek, korteks, anterior hyaloid: vitreus moleküler bileşimini özellikle altyapılardan düzeyinde yeterince anlaşılır bir yarı saydam bir jel. Vitreus çekirdek diyabetik retinopati gibi hastalıklar ile ilişkili olduğu, kondroitin sülfat proteoglikanlar, heparan sülfat proteoglikanların, ve vitreus çekirdek hyaluronan 1,2 Protein biyobelirteçleri ile birlikte kolajenlerin II, V, IX, ve XI içerir. 3-5 nasıl Bu proteinlerin farklı altyapılardan, her ifade ve özel protein kimlikler, birçok durumda bilinmemektedir. Bu ayrıntıları belirli Vitreoretinal hastalıklar ile ilişkili proteinlerin kökenini fikir vermek ve hedef gelecekte tedaviler yardımcı olabilir. Doku diseksiyonu için optimum post mortem aralığı tespit edilmemiş olmasına rağmen, protein bozulması downstream deneyler etkileyebilir. Örneğin, 12 saatlik postmortem gözünde immünohistokimya etkilenir ve bazı özel enzim aktiviteleri (basılmamış gözlem), birkaç saat içinde azalabilir. Bu çalışmada tüm dokuların protein ekspresyonu veya proteomik analsyis uygunluğu önemli değişiklikler olmadan ölüm 2 ve 8 saat arasında toplanmıştır. Korunması sıvı nitrojen dondurma yöntemi fiksatif çapraz bağlama, diğer dokularda LC-MS/MS tarafından kanıtlanmıştır neden protein yapısındaki küçük değişiklikler önlemek için fiksasyon üzerinde seçilen 6 Proteomik çalışmalar doğru bir şekilde yeteneğine bağlıdır Bu video deneyde ortaya vitreus farklı bölmeleri, teşrih. SDS-PAGE 1-boyutlu diseksiyon tekniği kullanılarak valide var. Sonuçlar, farklı çeşitli vitreus altyapılar proteinlerin ifade edilir. Bu proteinlerin belirlenmesi vitreus bölümlendirme daha ayrıntılı bir anlayış sağlayacak.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Finansman Fight for Sight tarafından sağlanan. Dokular Iowa Lions Göz Bankası elde edildi.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Isim | Şirket | Katalog Numarası | |
| 0.12 forseps | Storz Ophtalmics'in | E1502 | |
| 5-cc şırınga | Becton-Dickinson | 309603 | |
| Çentikler ile Düz Giyinme Forseps | Storz Ophtalmics'in | E1400 | |
| 23 iğne | Becton-Dickinson | 305145 | |
| Colibri forseps | Storz Ophtalmics'in | 2 / 132 | |
| Castroviejo açılı kornea makası | Storz Ophtalmics'in | E3223 | |
| Vannas Kavisli kapsülotomi Makas | Storz Ophtalmics'in | E3387 | |
| Weck-Cel cerrahi spears | Medtronic | 0008680 | |
| Westcott Kavisli tenotomisi Makas | Storz Ophtalmics'in | E3320 |
Kaynaklar
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).
- Yoshimura, T. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Azimzadeh, O. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
Yeniden basım ve izinler
