1. microRNA Hedefleme Özgünlüğünün Değerlendirilmesi: Sentetik microRNA Mimikleri Kullanılarak Virüs Yayılım Analizi
NOT: Sentetik bir microRNA mimiği kullanımı, microRNA:microRNA-hedef etkileşiminin özgüllüğünü göstermek için gerçekleştirilir.
- microRNA kaynaklı toksisiteyi değerlendirmek için her analizde mock transfeksiyon, negatif kontrol microRNA mimiği ve sadece deneysel microRNA mimiği kontrollerine yer verin. microRNA mimiklerinin düşük transfeksiyon verimliliği yanlış negatif sonuçlara yol açabileceğinden, pozitif bir kontrol (örneğin, microRNA hedefli gen veya genom) eklemek de idealdir.
- H1-HeLa hücrelerini, transfeksiyon anında (ekimden 24 saat sonra) %80-90 konfluense ulaşacak şekilde 96 kuyucuklu bir doku kültürü plakasına ekleyin. Hücreleri, %10 fetal bovine serum ile desteklenmiş DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) içerisinde kuyucuk başına 0,1 mL olacak şekilde ekleyin.
NOT: Bu analizi, ilgili microRNA'ları eksprese etmeyen ve viral replikasyona izin veren hücrelerde gerçekleştirin. - Transfeksiyon reaktiflerini oda sıcaklığına getirin. 9 µL serumsuz ortam, kuyucuk başına 200 nM final konsantrasyonunda microRNA mimiği stok çözeltisi, 0,18 µL boost reaktifi ve 0,18 µL transfeksiyon reaktifini birleştirip karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 2-5 dk inkübe edin.
NOT: Listelenen hacimler kuyucuk başınadır. Tutarlılığı sağlamak ve pipetleme hatalarını en aza indirmek için tüm kuyucukların transfeksiyonu için bir ana karışım (master mix) hazırlanması önerilir. Optimal microRNA mimiği konsantrasyonu değişiklik gösterecektir. Uygun bir başlangıç konsantrasyonu için microRNA mimiği ile birlikte gelen üretici talimatlarına bakın. Bu konsantrasyon genellikle 5-200 nM final konsantrasyonları arasında değişecektir. - Ortamı kuyucuklardan aspire edin ve 92 µL taze komplet ortam ekleyin.
NOT: Örnek sayısı fazlaysa, bu adımı transfeksiyon solüsyonunu hazırlamadan önce tamamlayın ve plağı hazır olana kadar 37 °C'de saklayın. - Transfeksiyon karışımının tamamını hücrelerin üzerine damla damla ekleyin.
- 37 °C'de 6 saat inkübe edin.
- Virüs yayılımının analizine olanak sağlamak amacıyla, hücrelerin düşük bir yüzdesinin enfekte olmasını sağlamak için her kuyucuğu düşük bir MOI (enfeksiyon çokluğu) ile enfekte edin. Bu protokolde 0,2 MOI kullanılmaktadır.
- Virüs stoklarını serumsuz ortamda, 100 µL başına MOI = 0,2 konsantrasyonuna seyreltin. Ortamı kuyucuklardan uzaklaştırın ve her kuyucuğa 100 µL virüs dilüsyonu ekleyin.
- 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
- Ortamı her kuyucuktan aspire edin ve 100 µL taze komplet ortam ekleyin.
- 37 °C'de 20-22 saat inkübe edin.
- Süpernatantlardaki virüs titrasyonunu belirleyin.
- Süpernatantı her kuyucuktan toplayın ve yerine 100 µL taze komplet ortam ekleyin.
NOT: Süspansiyon hücreleri kullanılıyorsa, sonraki adımdan elde edilen hücre peletini 100 µL taze komplet ortamda yeniden süspande edin ve viabilite analizi için örnek kuyucuğuna geri koyun. - Toplanan süpernatantlardaki hücresel döküntüleri 4 °C'de 5 dk boyunca 300 x g'de santrifüj ederek uzaklaştırın.
- Berraklaştırılmış süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve ilgili microRNA'ları eksprese etmeyen permisif hücrelerde enfeksiyöz virüsü titre edin.
NOT: Enfeksiyözlüğün kaybını önlemek için tüm örnekleri buz üzerinde tutun.
