İmmünostimülatör Protein Kodlayan Rekombinant Kızamık Virüsünün Üretimi

Özet

Kaynak: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, viral antigenomu ve temel yardımcı proteinleri kodlayan plazmidleri üretici hücrelere iletmek için lipozomlar kullanılarak rekombinant kızamık virüslerinin üretilmesini göstermektedir. Transkribe edilen ve replike olan RNA, immünostimülatör ve floresan raporlayıcı proteinler eksprese eden viral partiküllerin oluşumuna yol açar. Ardından, rekombinant virüs üretiminin başarılı olduğunu doğrulamak için sinsitya oluşumunu görselleştirmek amacıyla floresan mikroskopi kullanılır.

Protokol

NOT: [O], [P] ve [M] sırasıyla şunlar için geçerli alt bölümleri belirtir: genel olarak onkolitik virüsler (OV'ler), (çoğu) paramyksovirüsler veya sadece kızamık virüsü (MV). [B], bispesifik T hücresi bağlayıcı (BTE) transgenlerine özgü bölümleri belirtir.

1 İmmünomodülatör Kodlayan Transgenlerin Kızamık Virüsü Vektörlerine Klonlanması

1. [O] İnserte dizisini tasarlayın.
   1. [O] Literatür araştırmalarına veya genetik taramalar gibi keşif verilerine dayanarak ilgilenilen bir immünomodülatöre karar verin ve ilgili tamamlayıcı DNA (cDNA) dizisini GenBank, European Nucleotide Archive veya uluslararası ImMunoGeneTics bilgi sistemi (IMGT) gibi uygun veri tabanlarından elde edin.
   2. [O] Transgen dizisine ek özellikler ekleyin (Şekil 1). Önce gelen bir Kozak dizisi ve türe özgü kodon optimizasyonu ekspresyonu artırabilir. Sekresyon için sinyal dizileri gereklidir. Tespit ve saflaştırma için N- ve/veya C-terminal protein etiketlerini kodlayan dizileri ekleyin. Vektöre yerleştirme için restriksiyon bölgelerini ekleyin.
      NOT: [M] Rekombinant MV genomlarından transgen ekspresyonu için MV polimeraz geni başlangıç ve durdurma sinyalleri içeren ek transkripsiyon birimleri (ATU) gereklidir. Sito-megalovirüs (CMV) promotörleri tarafından kontrol edilen ve pozitif anlamlı transgenlerin belirlenmiş pozisyonlara yerleştirilmesi için benzersiz restriksiyon bölgelerine sahip ATU'lar içeren uygun anti-genomik cDNA vektörleri daha önce geliştirilmiştir. [P] Paramyxovirüsler için tipik olan ekspresyon gradyanı nedeniyle viral replikasyonu ve transgen ekspresyonunu etkilediğinden, transgenin uygun şekilde konumlandırılması kritik öneme sahiptir. Anti-genomun 3' ucuna yakın bir ATU'ya (yani lider pozisyonuna veya P geninin aşağısına) yerleştirme, genellikle viral replikasyonun azalması pahasına yüksek transgen ekspresyonu ile sonuçlanır. H geninin aşağısındaki ATU kullanıldığında ise artmış replikasyon ve daha düşük transgen ekspresyon seviyeleri beklenebilir. Kızamık virüsü dahil olmak üzere birkaç paramyxovirüsün genom paketlenmesi, her bir nükleokapsid proteininin altı nükleotide bağlanmasını gerektirir. Transgenlerin bu tür virüslere yerleştirilmesi için, tüm genomun nükleotid sayısının altıya bölünebilir olduğundan emin olun. Bu durum aynı zamanda "altı kuralı" olarak da adlandırılır. Gerektiğinde, çerçeve kaymalarına veya erken durdurma kodonlarına yol açmadan, insert içine (Kozak dizisinin yukarısına veya durdurma kodonunun aşağısına) ek nükleotidler ekleyin. [M] Transgende, MV gen başlangıç (AGGRNCMARGW) ve durdurma (RTTAWANAAAA) sinyallerine ve RNA düzenleme dizilerine (AAAAAGGG) benzer özel dizilerden kaçının.
   3. [O] İstenen dizideki oligonükleotidleri satın alın veya standart moleküler klonlama kullanarak mevcut dizilerden birleştirin.
      NOT: [O] Transgenin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu için, yukarı akış restriksiyon bölgesini ve insertin ilk 15-20 nükleotidini içeren bir ileri primer ile insertin son 15-20 nükleotidini takip eden aşağı akış restriksiyon bölgesini içeren bir geri primer tasarlayın.
2. [O] Inserti viral (anti-)genomu kodlayan DNA'ya klonlayın.
   1. [O] Standart moleküler klonlama teknikleri (yani, enzimatik restriksiyon ve ardından DNA ligasyonu) ile inserti DNA vektörlerine veya RNA virüslerinin DNA anti-genomlarına klonlayın.
      1. [O] Uyumsuz restriksiyon bölgeleri kullanarak veya ligasyon öncesinde defosforilasyon yaparak vektörün yeniden ligasyonunu önleyin.
      2. [O] Ligasyon ürününü agaroz jel elektroforezi ve ardından ticari olarak mevcut kitler kullanılarak jel saflaştırması ile izole edin. Genel olarak, optimal ligasyon verimi 3:1 insert/vektör molar oranında elde edilir.
   2. [O] Ligasyon ürününü, büyük plazmidlerin verimli bir şekilde geri kazanımı için uygun kompetan bakterilere transforme edin (yani, E. coli ısı şoku uygulayın) ve doğru DNA'yı taşıyan bakteriyel klonları koloni PCR'ı ile belirleyin.
   3. [O] Ticari olarak mevcut DNA hazırlama kitlerini kullanarak tek bir bakteriyel klondan amplifiye edilmiş DNA'yı izole edin. Genomik bütünlüğü uygun restriksiyon enzimleri ile kontrol sindirimi yaparak onaylayın (örneğin, MV genomları için HindIII [M]). Transgenin doğru yerleşimini ve bütünlüğünü dizileme ile doğrulayın.
      NOT: [M] MV H-ATU'ya yerleştirilen transgenler için şu primerler ile Sanger dizilemesi gerçekleştirin: H-9018 [ileri primer, H açık okuma çerçevesindeki (ORF) MV genom pozisyonu 9018'e bağlanır]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'; L-9249+ (geri primer, L ORF'deki MV genom pozisyonu 9249'a bağlanır): 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

2. İmmünomodülatörleri Kodlayan Rekombinant Kızamık Virüsü Partiküllerinin Elde Edilmesi

1. [O] İlgili virüs için standart protokole uygun olarak, virüs üretici hücrelerin transfeksiyonu yoluyla (anti-)genomik DNA'dan rekombinant virüs partikülleri üretin. Steril koşullar altında çalışma kılavuzlarını izleyin. Hücre kültürünü çeker ocaklar altında, özellikle virüs içeren tüm adımları sınıf II biyolojik güvenlik kabinlerinde gerçekleştirin.
   1. [M] cDNA'dan kızamık virüslerinin kurtarılması için, transfeksiyondan 24 saat önce MV üretici (Afrika yeşil maymun böbreği kaynaklı Vero) hücrelerini 6 kuyucuklu bir plakaya eşit şekilde ekin. Transfeksiyon anında %65–75 konfluens elde etmek için her kuyucuğa, %10 fetal bovine serum (FBS) içeren 2 mL Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) içinde 2 x 10⁵ hücre ekin.
      NOT: [P] Virüsle indüklenen sinsitya oluşumundan önce hücreler aşırı büyürse hücre sayılarını azaltın.
   2. [P] Hücreleri viral anti-genomu, gerekli yardımcı plazmidleri ve istenirse transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için floresan bir raporlayıcıyı kodlayan DNA ile transfekte edin.
      1. [M] Kızamık virüsü anti-genomunu kodlayan 5 µg rekombinant DNA'yı, kızamık virüsü N ve L proteinlerini kodlayan memeli ekspresyon plazmidlerinden her birinden 500 ng'ı ve P proteinini kodlayan plazmidlerden her birinden 100 ng'ı toplam 200 µL DMEM hacminde karıştırın. Transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek istenirse (ve viral anti-genom konstrüktü içinde halihazırda mevcut değilse), 100 ng floresan raporlayıcı plazmid ekleyin.
      2. 18,6 µL lipozomal transfeksiyon reaktifi ekleyin, tüpü hafifçe sallayarak hemen karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 25 dakika inkübe edin.
      3. [P] Besiyerini her kuyucuk için 1,8 mL DMEM, %2 FBS, 50 µg/mL kanamisin (veya kontaminasyonu önlemek için diğer antibiyotikler) ile değiştirin, ardından transfeksiyon karışımını kuyucuğa damla damla ekleyin ve dikkatlice çalkalayın. Hücreleri 37 °C, %5 CO₂'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün besiyerini 2 mL taze DMEM, %2 FBS ve 50 µg/mL kanamisin ile değiştirin; besiyeri asidleştiğinde bu işlemi tekrarlayın.
         DİKKAT: [O] Transfeksiyondan sonraki adımlar boyunca virüs mevcut olabileceğinden, hücreleri ve materyalleri biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak yönetin. (Potansiyel olarak) enfeksiyöz atıkları uygun şekilde bertaraf edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Bir kızamık virüsü genomunun şematik gösterimi. Geliştirilmiş yeşil floresan protein (eGFP), lider (ld) dizisinin aşağısındaki ek bir transkripsiyon biriminde kodlanmıştır. N, P, M, F, H ve L; sırasıyla kızamık virüsü yapısal proteinleri olan nükleoprotein, P proteini, matris proteini, füzyon proteini, hemaglütinin proteini ve büyük proteini (polimeraz) kodlayan genleri belirtir ve yukarıda görselleştirildiği gibi farklı şekilde eksprese edilirler. Bispesifik T hücresi bağlayıcı (BTE) transgeni, H açık okuma çerçevesinin aşağısındaki ek bir transkripsiyon birimine (ATU) yerleştirilmiştir. Transgen, etkili salgılanma için bir immünoglobulin kappa (Igκ) lider peptidinin yanı sıra tespit ve saflaştırma için influenza hemaglütinin (HA) ve heksa-histidin (His) protein etiketlerini kodlar. Sırasıyla CD3 ve CD20'yi hedefleyen antikorların değişken ağır zincir (VH) ve değişken hafif zincir (VL) domenlerini kodlayan genler, glisin (G) ve serin (S) kalıntıları içeren peptid bağlayıcı diziler aracılığıyla birbirine bağlanmıştır. Transgen dizisinden önce bir Kozak dizisi yer alır. Kodlama bölgesinin aşağısında, altı kuralına uymak amacıyla örnek olarak ek nükleotidler eklenmiştir. İnset kaseti, ilgili ATU'ya yerleştirmeyi sağlayan iki restriksiyon bölgesi ile çevrelenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit	Roche Life Science, Mannheim, Germany	4898117001
CloneJET PCR Cloning Kit	Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot	K1231
Agaroz	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A9539-500G
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN, Hilden, Germany	28704
NEB 10-beta Kompetan E. coli	New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany	C3019I
QIAquick Miniprep Kit	QIAGEN, Hilden, Germany	27104
Restriksiyon enzimi HindIII-HF	New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany	R3104S
Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021
Fetal sığır serumu (FBS)	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500
FugeneHD	Promega, Mannheim, Germany	E2311	tercih edilen başka bir transfeksiyon reaktanıyla değiştirilebilir
Kanamisin	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	K0129
Vero hücreleri	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81
6 kuyucuklu plakalar	Neolab, Heidelberg, Germany	353046