Bu video, viral replikasyonu incelemek amacıyla, üretilmeleri ve hasat edilmeleri için böbrek epitel hücrelerinin genetiği değiştirilmiş virüslerle enfekte edilmesi sürecini göstermektedir.
Yöntem makalesi
Terapötik Virüs Üreten Epitel Hücrelerin Üretimi ve Hasadı
8 görüntülenme
⸱
30 Eylül 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
- İmmünomodülatör Kodlayan Viral Vektörlerin Replikatif ve Sitotoksik Kapasitelerinin Belirlenmesi
Oluşturulan rekombinant virüsün ve modifiye edilmemiş vektörün replikasyon kinetiklerini tek basamaklı veya çok basamaklı büyüme eğrileri (GC'ler) ile karşılaştırın. Tek basamaklı GC'lerde, tüm hücrelerin eş zamanlı enfeksiyonundan sonra (teorik olarak %100 enfeksiyon) viral progeniler değerlendirilir. Çok basamaklı GC'ler, birkaç tur virüs replikasyonunu takip etmek için düşük bir enfekte hücre yüzdesi ile başlar.
- Kızamık virüsü replikasyon kinetiği analizleri için, enfeksiyondan bir gün önce 12 kuyucuklu plakalarda, her kuyucuğa 10% FBS (fetal bovine serum) içeren 1 mL DMEM (dulbecco’s modified eagle medium) içerisinde 1 x 105 Vero hücresi ekleyin. İlgilenilen her zaman noktası için teknik tekrarlar olarak en az iki kuyucuk hazırlayın.
- Vero hücrelerinde replikasyon için hücreleri, çok basamaklı büyüme eğrileri (GC) için düşük MOI (multiplicity of infection) veya tek basamaklı büyüme eğrileri için yüksek MOI (MV veya kızamık virüsü için sırasıyla 0.03 ve 3) ile enfekte edin. Besiyerini, ilgili miktarda virüs içeren 300 µL serumsuz besiyeri ile değiştirin ve 37 °C ve 5% CO2 sıcaklığında en az 2 sa boyunca inkübe edin. İnokülumu uzaklaştırın, 10% FBS içeren 1 mL DMEM ekleyin ve inkübasyona devam edin.
- Enfeksiyondan sonra 12, 24, 36, 48, 72 ve 96 sa gibi ilgili zaman noktalarında, hücreleri doğrudan besiyerine kazıyarak viral progenyleri hasat edin. Her kuyucuktaki içeriği ayrı bir tüpe aktarın, sıvı azot ile şoklayarak dondurun ve titrasyona kadar -80 °C'de saklayın.
NOT: Ortalama titrelerin analizi için replika örnekler bu aşamada birleştirilebilir. - Tüm zaman noktalarından örnekleri toplayın. Viral progenylerin değerlendirilmesi için 37 °C'de eş zamanlı olarak çözdürün. Vorteksleyin ve hücre kalıntılarını 2,500 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüj ederek çöktürün.
- Yukarıda açıklandığı şekilde her bir konstrükt ve zaman noktası için ortalama titreleri hesaplayın. Titreleri zamanla grafiğe dökün. Transgen eklenmiş ve eklenmemiş vektörlerin, farklı transgenler içeren vektörlerin veya transgenleri farklı pozisyonlara eklenmiş vektörlerin büyüme eğrilerini karşılaştırın (bkz. Şekil 1).
Sonuçlar
Şekil 1: Rekombinant kızamık virüslerinin replikasyon kinetiği ve litik aktivitesi. (A) Vero hücrelerinin modifiye edilmemiş onkolitik kızamık virüsü (MV) veya bispesifik T hücresi bağlayıcı kodlayan kızamık virüsü (MV-H-mCD3xhCD20) ile 1 MOI'de enfekte edilmesinin ardından tek aşamalı büyüme eğrileri oluşturulmuştur. Viral progenylerin titrleri, enfeksiyondan sonra belirlenen zaman noktalarında değerlendirilmiş ve benzer virüs replikasyon kinetiği göstermiştir. Sekiz örneğin (her zaman noktası için iki biyolojik tekrardan her birinin dört teknik tekrarları) ortalamaları ve standart sapmaları gösterilmiştir. (B) İnsan karsinoembriyonik antijen ve MV reseptörü CD46'yı stabil olarak eksprese eden MC38 fare kolorektal karsinom hücrelerinde (MC38-CEA-CD46) hücre canlılığı, yalnızca besiyeri (mock) veya belirtilen virüslerin 1 MOI'de inokülasyonundan sonra değerlendirilmiştir. XTT hücre canlılık testi belirtilen zaman noktalarında gerçekleştirilmiştir. Modifiye edilmemiş vektör için hücre canlılığındaki azalma daha erken zaman noktalarında gözlemlenmiştir. MV-H-mCD3xhCD20 için 12. saat zaman noktasında hesaplanan %100'ün üzerindeki değerler, enfeksiyondan kısa süre sonra sıklıkla gözlemlenir ve bu durum hücresel stresten veya virüs süspansiyonunda bulunan hücre kaynaklı faktörlerden kaynaklanabilir. Her zaman noktası için üç teknik tekrarın ortalama değerleri ve standart sapmaları gösterilmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 31966-021 | Vero hücrelerinin ekimi ve enfeksiyonu için kullanılır |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biosera, Boussens, France | FB-1280/500 | DMEM takviyesi için |
| Vero hücreleri | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | Kızamık virüsü propagasyonu ve analizi için konak hücreler |
| 12 kuyucuklu plaklar | Neolab, Heidelberg, Germany | 353043 | Vero hücrelerinin ekimi için (kuyucuk başına 1 × 10⁵) |
| Opti-MEM (serumsuz ortam) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 31985070 | Virüs enfeksiyon adımı için (serumsuz inkübasyon) |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 14190-094 | Yıkama ve ortam hazırlama için |
| Hücre sıyırıcı | Corning, Reynosa, Mexico | 3008 | Hasat sırasında enfekte hücreleri sıyırmak için kullanılır |
| 50 mL tüpler | nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany | 02-572-3001 | Örnek toplama ve santrifüjleme için |
| Sıvı azot | — | — | Hasat edilen viral örneklerin şok dondurulması için |
| Santrifüj (2,500 × g kapasiteli) | — | — | Hücre kalıntılarını çöktürmek için |
| XTT Hücre Canlılığı Kiti (Colorimetric Cell Viability Kit III) | PromoKine, Heidelberg, Germany | PK-CA20-300-1000 | XTT reaktifi içerir; sitotoksisite ölçümü için |
| 96 kuyucuklu plaklar, düz tabanlı | Neolab, Heidelberg, Germany | 353072 | 450 nm'de absorbans ölçümü için |
| Spektrofotometre / Mikroplaka okuyucu | — | — | 450 nm'de optik absorbansı ölçmek için (referans 630 nm) |
| Karbondioksit inkübatörü | — | — | Tüm hücre inkübasyonları için 37 °C, 5% CO₂ |
