Viral Kodlu Bir Bispesifik T-hücre Bağlayıcının İmmünomodülatör Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Heidbuechel, J. P., et al. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Bu video, viral olarak kodlanmış bir bispesifik T-hücresi bağlayıcısının (BTE) hedefe özgü immünomodülatör aktivitesini değerlendirmek için kullanılan hücre tabanlı bir analizi göstermektedir. BTE, hedef reseptör eksprese eden tümör hücrelerini T hücreleri ile birbirine bağlayarak tümör lizisini ve enzim salınımını tetikler. Substrat dönüşümüne dayalı kolorimetrik bir okuma, T-hücresi aktivasyonunu gösterir. Test örneğindeki daha yüksek renk yoğunluğu, BTE aracılı, reseptöre özgü immün etkileşimi doğrular.

Protokol

1. İzole edilen immünomodülatörlerin immünolojik fonksiyonelliğini değerlendirin.
   1. Aşağıda, bispesifik T-hücresi bağlayıcı (BTE)-indüklü, hücre aracılı sitotoksisitenin laktat dehidrogenaz (LDH) salınım testi ile nasıl değerlendirileceği ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
      1. Deney sırasında test edilecek koşullara karar verin (örnek olarak Şekil 1'e bakınız). Zaman noktaları (saatten güne), immünomodülatör konsantrasyonları (pg/mL'den µg/mL'ye) ve efektör/hedef hücre (E:T) oranları (örneğin 1:50 ile 50:1 arası) değiştirilebilir. Örnekleri her zaman üç tekrar halinde hazırlayın.
      2. BTE proteini içermeyen ve efektör hücre içermeyen örnekleri, tekil hücre tiplerinin spontan LDH salınımı için kontrolleri (Tsp ve Esp), okuma öncesinde deterjan eklenmiş bir hedef hücre maksimum lizis kontrolünü (Tmax), sadece besiyeri içeren bir kontrolü ve Tmax için bir hacim kontrolünü ekleyin.
         NOT: Gerekli hedef hücre sayıları ve inkübasyon süreleri farklılık gösterebilir. Optimal parametreleri belirlemek için efektör hücreler ve immünomodülatörler olmadan başlangıç test çalışmaları gerçekleştirin. Farklı hücre sayılarını ve zaman noktalarını değerlendirmek için Tsp ve Tmax örneklerini ve ilgili kontrollerini dahil edin.
      3. İmmün efektör hücreleri izole edin (örneğin, periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) elde etmek için insan kanının yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile veya fare splenositlerinden murin T hücrelerinin negatif seleksiyonu ile).
      4. Hedef hücreleri (örneğin, kuyuk başına 5 x 10³) U-tabanlı 96 kuyucuklu bir plakaya ekleyin.
      5. İzole edilen proteini istenen konsantrasyonlarda ilgili örneklere ekleyin. İmmün efektör hücrelerini istenen oranlarda ekleyin. Kuyuk başına toplam 100 µL hacme ulaşacak şekilde besiyeri ekleyin.
      6. Belirlenen zaman aralığı boyunca (stimüle edilmemiş PBMC'ler için 24 sa ve yeni izole edilmiş murin T hücreleri için 48 sa; ön stimüle edilmiş immün hücreler için daha kısa inkübasyon süreleri uygulanabilir), 37 °C ve %5 CO₂ altında inkübe edin.
      7. Örnekleri toplamadan 45 dakika önce, Tmax örneklerini ve ilgili besiyeri kontrollerini içeren kuyucuklara 10 µL 10x lizis çözeltisi ekleyin. İnkübasyona devam edin.
      8. Hücreleri 250 x g'de 4 dk boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Her süpernatanttan 50 µL'yi düz tabanlı 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Hücreye bağlı LDH'den kaçınmak için hücreleri aktarmayın.
      9. Substrat çözeltisini üretici talimatlarına göre hazırlayın. Her kuyucuğa 50 µL ekleyin ve oda sıcaklığında [RT], karanlıkta 30 dk boyunca veya Tmax örnekleri koyu kırmızıya dönene kadar inkübe edin.
      10. Her kuyucuğa 50 µL stop çözeltisi ekleyin. Hava kabarcıklarını 4,000 x g'de 1 dk santrifüjleyerek ve manuel olarak içi boş bir iğne ile giderin. Optik absorbansı 490 nm'de ölçün.
      11. Her örnek için % spesifik lizis değerlerini hesaplayın.
          1. Lizis çözeltili ve çözeltisiz besiyeri kontrol tekrarları için ortalamaları hesaplayın. Elde edilen değerleri sırasıyla deneysel örneklerden ve Tmax ile spontan salınım kontrollerinden çıkarın. İleriki hesaplamalar için bu arka plan düzeltmeli değerleri kullanın.
          2. Arka plan düzeltmeli Tmax, Tsp ve Esp kontrolleri için ortalamaları hesaplayın. Bu ortalama değerler kullanılarak, aşağıdaki denklem her örnek için spesifik lizis yüzdesini verir:
             
          3. % spesifik lizis değerlerini protein konsantrasyonuna veya E:T oranına karşı grafikleştirin ve hedefleyici olmayan kontrol örneklerle karşılaştırın.

Sonuçlar

Şekil 1: Kızamık virüsü kodlu BTE'lerin sitotoksik aktivitesi. Hedef tümör hücreleri (kuyu başına 5 x 10³ B16-CD20-CD46 hücresi), murine T hücreleri ile 1:50 oranında inkübe edildi. MV(Kızamık virüsü)-H-mCD3xhCD20 enfekte hücrelerin süpernatantından önceden saflaştırılmış BTE'ler (Bizispesifik T-hücre bağlayıcılar) belirtilen konsantrasyonlarda eklendi. Hedef hücrelerin göreceli lizisi, 48 saat sonra LDH salınım analizi ile değerlendirildi. BTE hedef antijeninden yoksun hücreler (B16-CD46), antijene özgü sitotoksisiteyi değerlendirmek için referans olarak kullanıldı. Örnek başına üç teknik tekrardan elde edilen ortalamalar ve standart sapmalar gösterilmiştir. Hedef antijen eksprese eden hücreler, BTE konsantrasyonuna bağımlı olarak spesifik şekilde lize edildi. BTE ürününün saflığı ve hedef antijen ekspresyon seviyeleri hücre öldürmeyi etkiler. Mevcut örnekte, 1 µg/mL gibi nispeten yüksek bir BTE konsantrasyonunda %15 spesifik hücre öldürme sağlandı. Bu, uzun ko-inkübasyon süreleri ve suboptimal T hücresi kültür koşullarına sahip böyle bir deneysel düzenek için tipik bir değerdir. Diğer düzeneklerde, MV enfekte süpernatantlardan saflaştırılmış BTE'ler kullanılarak %60'a varan spesifik öldürme elde edilmiş ve 100 ng/mL ve üzerindeki BTE konsantrasyonlarında bir platoya ulaşılmıştır. Bu durum, sezgiye aykırı olarak, bu analiz yönteminin limitinin %100 spesifik öldürmeden daha düşük olduğunu göstermektedir; bu durum, Tmax kontrollerindeki büyüme kinetiğinin ko-kültür örneklerine kıyasla farklı olmasıyla açıklanabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021
Fetal bovine serum (FBS)	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500
Kanamycin	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	K0129
B16-CD46/ B16-CD20-CD46	J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg		talep üzerine temin edilebilir
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)	PromoKine, Heidelberg, Germany	PK-CA20-300-1000	XTT reajenini içerir
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin Columns	QIAGEN, Hilden, Germany	31014
96 kuyucuklu plakalar, U-tabanlı	TPP, Trasadingen, Switzerland	92097
96 kuyucuklu plakalar, düz tabanlı	Neolab, Heidelberg, Germany	353072