Bakteriyel Yapay Kromozom Kaynaklı Sentetik RNA ile Transfekte Edilen Hücrelerden İnfektif Viriyonların Elde Edilmesi

Özet

Kaynak: Yun, S. et al. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (2015)

Bu video, bakteriyel yapay kromozom klonundan transkribe edilen sentetik RNA'dan enfeksiyöz Japon ensefaliti virüsünün geri kazanımını göstermektedir. Hücrelerin sentetik RNA ile nasıl elektropore edildiğini ve böylece viral genomun yeni virionların üretimini nasıl yönlendirdiğini göstermektedir. Enfekte hücre monotonlarında oluşan plaklar, enfeksiyöz virüsün başarılı bir şekilde kurtarıldığını doğrulamaktadır.

Protokol

1. RNA Enfeksiyözlüğünün ve Virüs Veriminin Belirlenmesi

1. Baby hamster kidney-21 (BHK-21) hücrelerini 150 mm kültür kaplarında, 3 × 10⁶ hücre/kap yoğunluğunda, 37 °C'de %5 CO₂ ile 24 saat boyunca kültüre edin.
   NOT: BHK-21 hücrelerini %10 fetal sığır serumu, 2 mM glutamin, vitaminler ve penisilin/streptomisin ile desteklenmiş alfa minimum esansiyel besiyerinde muhafaza edin.
2. Hücre monotabakasını 10 ml soğuk Çözelti A (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na₂HPO₄ ve 1.5 mM KH₂PO₄) ile durulayın. Hücreleri 4 ml tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (%0,25) ile muamele ederek kaplardan ayırın ve bir masaüstü santrifüjde 270 × g'de 2 dakika boyunca santrifüjleyerek toplayın.
3. Hücre peletini 50 ml'lik konik bir tüp içinde 50 ml soğuk Çözelti A ile yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonunu 270 × g'de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın; son yıkamadan sonra hücre peletini Çözelti A içerisinde 2 × 10⁷ hücre/ml yoğunluğunda yeniden süspande edin.
4. Hücre süspansiyonunun 400 µl'lik bir alikotunu 2 µg sentetik RNA ile 2 mm aralıklı bir küvette karıştırın ve karışımı vakit kaybetmeden optimal elektroporasyon koşulları altında (980 V, 99 µsec pals uzunluğu ve 5 pals) bir elektroporatör ile elektropore edin (Şekil 1C).
5. Elektropore edilmiş hücreleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika bekletin ve 600 µl tam kültür besiyeri içeren 1,7 ml'lik bir mikrotüpe aktarın.
6. Elektropore edilmiş hücrelerin 1 ml tam kültür besiyeri içinde 10 katlık seri dilüsyonlarını hazırlayın ve her dilüsyonun 100 µl'lik bir alikotunu 6 kuyucuklu bir plaka içindeki elektropore edilmemiş BHK-21 hücrelerinin (5 × 10⁵) monotabakaları üzerine ekleyin.
7. 4-6 saatlik inkübasyonun ardından, hücrelerin üzerini %10 fetal sığır serumu içeren minimum esansiyel besiyerindeki %0,5'lik agaroz ile kaplayın. Plakaları 37 °C'de %5 CO₂ ile 4 gün boyunca inkübe edin.
8. Enfeksiyöz merkezleri (plakları), %7 formaldehit ile tespit ederek ve %5 etanoldeki %1'lik kristal viyole ile boyayarak görselleştirin (Şekil 2A).
   1. Opsiyonel: RNA-elektropore edilmiş hücreleri, transfeksiyondan 18-20 saat sonra immünofloresan analizler ile Japon ensefalit virüsü (JEV) protein ekspresyonu açısından inceleyin (Şekil 2B) ve plak analizleri ile virüs titrasyonu yapmak için RNA-elektropore edilmiş hücrelerin süpernatantlarını transfeksiyondan 22 ve 40 saat sonra toplayın (Şekil 2C).

Sonuçlar

Şekil 1. Bakteriyel yapay kromozom (BAC) içinde birleştirilmiş tam uzunluktaki JEV SA₁₄-14-2 tamamlayıcı DNA'dan (cDNA) enfeksiyöz virüslerin geri kazanımının genel görünümü. (A) cDNA şablonunun doğrusallaştırılması. Tam uzunluktaki JEV BAC, XbaI ile kesilir ve mung fasulyesi nükleazı (MBN) ile işleme tabi tutulur. (B) RNA transkriptlerinin sentezi. Doğrusallaştırılmış cDNA, m⁷G(5')ppp(5')A kep analoğu varlığında SP6 RNA polimeraz tarafından transkribe edilir. (C) Sentetik JEV'lerin geri kazanımı. In vitro transkribe edilen RNA'lar, yüksek titreli sentetik virüs üreten elektroporasyon yoluyla BHK-21 hücrelerine transfekte edilir.

Şekil 2. Tam uzunluktaki JEV BAC'tan transkribe edilen sentetik RNA'ların spesifik enfektivitesi ve sentetik virüsün geri kazanımı. BHK-21 hücreleri yalancı elektrolporasyonla işlem görmüş (Mock) veya tam uzunluktaki JEV BAC'ın iki bağımsız klonundan türetilen RNA transkriptleri ile elektropore edilmiştir (Cl.1 ve Cl.2). (A) RNA enfektivitesi. Hücrelerin üzeri agaroz ile kaplanmış ve transfeksiyondan 4 gün sonra kristal viyole ile boyanmıştır. Hücrelere elektropore edilen enfeksiyöz RNA miktarını tahmin etmek için RNA enfektivitesi, enfeksiyöz merkez analizleri ile belirlenmiştir (sol panel). Ayrıca, enfeksiyöz merkezlerin temsili görüntüleri gösterilmiştir (sağ panel). (B) Protein ekspresyonu. Hücreler 4 kuyucuklu oda lamlarında kültüre edilmiştir. RNA-elektropore edilen hücrelerde transfeksiyondan 20 saat sonraki (hpt) viral protein ekspresyonu; primer anti-yapısal olmayan protein 1 (NS1) tavşan antiserumu ve sekonder Cy3-konjuge keçi anti-tavşan immünoglobulin G (IgG) (kırmızı) kullanılarak immünofloresan analizlerle incelenmiştir. Çekirdekler 4',6-diamidino-2-fenilindol (mavi) ile karşı boyanmıştır. İmmünofloresan görüntüler, karşılık gelen diferansiyel girişim kontrast görüntülerinin üzerine bindirilmiştir. (C) Virüs verimi. Hücreler 150 mm'lik kültür kaplarında kültüre edilmiştir. RNA-elektropore edilen hücrelerin kültür süpernatantlarında transfeksiyondan 22 ve 40 saat sonra (hpt) biriken enfeksiyöz virion üretimi, plak analizleri ile incelenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Alfa Minimum Esansiyel Besiyeri	Life Technologies (Gibco)	12561-049
Agaroz	Lonza	50004
Konik Tüp (50 mL)	VWR	21008-242
Kristal Viyole	Sigma-Aldrich	C0775
Kültür Kabı (150 mm)	TPP	93150
Küvet (2-mm Aralık)	Harvard Apparatus	450125
Fetal Bovin Serum	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldehit	Sigma-Aldrich	F1635	Toksik ve karsinojenik
Glutamin	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Minimum Esansiyel Besiyeri	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Penisilin/Streptomisin	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Potasyum Klorür	Sigma-Aldrich	P3911
Potasyum Fosfat Monobazik	Sigma-Aldrich	P9791
Altı Kuyucuklu Plaka	TPP	92006
Sodyum Klorür	Sigma-Aldrich	S3014
Sodyum Fosfat Dibazik	Sigma-Aldrich	S3264
Tripsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies (Gibco)	25200-056
Vitaminler	Sigma-Aldrich	M6895
CO₂ İnkübatörü	Thermo Scientific	Heracell 150i
Masaüstü Santrifüj	Thermo Scientific	ST16R
Elektroporatör	Harvard Apparatus	ECM 830