Method Article

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

DOI:

10.3791/2536

⸱

April 27th, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco, 2Division of Infectious Diseases, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virochip korunmuş dizi homoloji temelinde aynı anda, bilinen tüm virüsleri yanı sıra roman virüsler tespit etmek için tasarlanmış bir pan-viral mikroarray. İşte biz, varlığı bilinen ve bilinmeyen virüslere hem de klinik örnekleri analiz etmek için bir Virochip tahlil nasıl çalıştırılacağını göstermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virüslerin doğal dizisi çeşitliliği yanı sıra, geleneksel yöntemlerle algılanamaz SARS coronavirüs ve 2009 pandemik H1N1 influenza virüsü gibi roman viral patojenler, devam eden ortaya çıkması nedeniyle, pek çok bulaşıcı hastalıkların viral nedenlerin tanısı zordur. Bu zorlukları ele almak için, daha önce geliştirilmiş ve kapasitesi ile korunmuş sıra homoloji 1 dayanarak, bilinen tüm virüsleri yanı sıra roman varyantları tespit etmek için Virochip denilen bir pan-viral mikroarray platformu valide . Virochip kullanarak, tam spektrum, eşdeğer ya da geleneksel klinik test 2-5 üstün bir hassasiyet ile hastanede yatan hastalarda açıklanamayan kritik hastalık vakaları da dahil olmak üzere, solunum yolu enfeksiyonları ile ilişkili virüs tespit ettik. Virochip ayrıca, SARS coronavirüs 6,7, bir roman rinovirüs dalının 5, XMRV (prostat kanseri ile bağlantılı bir retrovirüs) 8, kuş bornavirus (papağanlar bir israf hastalığı nedeni) 9, dahil olmak üzere, yeni virüsleri tanımlamak için kullanılır olmuştur solunum ve ishal hastalık 10 ile çocuklarda ve yeni bir cardiovirus. Virochip güncel sürümü Agilent mikroarray platforma taşıdık ve ~ 36.000 probları Aralık 2009 itibariyle GenBank ~ üzerinde 1.500 virüslerden kaynaklanan oluşur. Burada örnek nükleik asit ekstraksiyon, rastgele primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu, floresan boya dahil, ve mikroarray hibridizasyon, tarama ve analiz de dahil olmak üzere, (~ 24 saat gerçekleştirme süresi) bitirmek için baştan bir Virochip testi işleme dahil adımları ortaya koymaktadır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virochip testinin adımlar (1) klinik örneklerden nükleik asit ekstraksiyon, (2) çıkarılan RNA ters transkripsiyon ve 2. iplikçik cDNA sentezi, rastgele astarlanmalıdır cDNA (3) PCR, (3) Cy3 floresan boya dahil (4) Virochip mikroarray etiketli malzeme hibridizasyon ve (5) tarama ve analizi (Şekil 1). Aşağıda gösterilen protokol grip benzeri bir hastalığa sahip bir çocuğun bir nazal sürüntü örneği Virochip testinin kullanımını göstermek.

Primer Diziler

Primer bir 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N 9) -3 '

Primer B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '

1. Nükleik Asit Ekstraksiyonu

  1. Bu örnekleri potansiyel bulaşıcı olarak klinik örneklerden nükleik asit ekstraksiyon, Biyolojik Güvenlik Seviye 2 (BSL-2) veya daha yüksek koşulları altında yapılmalıdır.
  2. Nazal sürüntü örneği viral tutarak orta taşınır. 1.5 ml Eppendorf mikrosantrifüj tüp içine örnek kısım 200 mcL.
  3. İsteğe Bağlı: 0.22 mikron filtre (viral parçacıkların arındırmak için) geçmesine örnek
  4. İsteğe bağlı: Turbo DNAz kiti (Ambion) kullanarak üreticinin talimatlarına göre DNAz (ana bilgisayar genomik DNA aşağılamak ve arındırmak için korumalı, encapsidated viral nükleik asit) ile ön işlemden örnek
  5. Zymo ZR viral RNA Ekstraksiyon Kiti veya üreticinin talimatlarına göre Qiagen Ultrasens Virus Kit kullanarak örnek ayıklayın.

2. Ters Transkripsiyon ve 2.-iplikçik cDNA sentezi ("Yuvarlak A")

  1. 4 uL çıkarılan RNA 1 uL 40 mcL / pmol Primer ekleyin. Isı 65 ° C PCR (örneğin GeneAmp PCR Sistemi 9700) ve daha sonra 5 dakika boyunca oda sıcaklığında x 5 dakika soğumasını bekleyin.
  2. 2 mcL 5X RT tampon, 1 mcL 12.5 mM dNTP, 1 mcL su, 0.5 mcL 0.1M DTT, ve 0.5 mcL SSIII RT (Invitrogen) oluşan bir ana karışımı 5 mcL ekleyin. 42 ° C'de x 60 dakika.
  3. Programlanabilir bir PCR, ısı 94 ° 10 serin C x 2 dk (iptal etmek için ters transkriptaz reaksiyonu), ° C, nabız santrifüj, ve ardından 1 mcL 5X Sequenase tampon, 3.8 mcL su oluşan 5 mcL Sequenase karışımı ekleyin, 0.15 mcL Sequenase (USB Corporation). 2. iplikçik sentez için, 10 ° C - 37 ° C 8 dk boyunca, 94, 8 dakika sonra, ısı tutun ° C x 2 dk (Sequenase inaktive etmek için) ve 10 ° C (basılı tutun) serin kadar rampa
  4. İsteğe bağlı: Rd örnek bir cDNA -20 ° C'de bu noktada saklanabilir

3. PCR Amplifikasyon rastgele Astarlı cDNA ("Yuvarlak B")

  1. 5 Rd uL bir örnek, 45 mcL 5 mcL 10X PCR buffer, 1 mcL 12.5 mM dNTP, 1 mcL 100 pmol / mcL astar B, 1 mcL KlenTaq LA (Sigma), ve 37 mcL su oluşan bir ana karışımı ekleyin .
  2. PCR protokolü aşağıdaki gibi çalıştırın: 94 ° C, 2 dakika → (25 devir 94 ° C, 30 / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 dak.) → 72 ° C, 5 dk → 10 ° C ( basılı tutun)
  3. % 1.5 agaroz elektroforez jel üzerinde Rd B numunesi kontrol edin. A smear yaklaşık 200 - 1000 bp görüntülenmeyecektir gerekir (Şekil 2A)

4. Cy3 Floresan Boya Kuruluş

  1. İsteğe Bağlı: Cy5, floresan boya ile başka bir örnek etiketli olabilir ve aynı mikroarray için melezleşmiştir.
  2. Aa-dNTP birleştirmek için, 5 uL 10X PCR buffer, 1 uL 12.5 mM aa-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / uL astar Yatak, 1 oluşan bir ana karışımı 45 uL Rd B numunesinin 5 uL 1 uL KlenTaq LA (Sigma), ve 37 uL su. PCR protokolü aşağıdaki gibi çalıştırın: 94 ° C, 2 dakika → (15 döngü 94 ° C, 30 / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 dak.) → 72 ° C, 5 dk → 10 ° C ( basılı tutun)
  3. Rd C örnek üreticinin talimatlarına göre DNA Temiz ve Konsantratörü-5 Seti (Zymo Araştırma) ile temizleyin. 10 mcL Zehir.
  4. 1M bikarbonat 1 uL (Sigma) ve Rd C Örnek 1 uL Cy5 (GE Healthcare) ekleyin.
  5. Inkübe x 1 saat karanlıkta.
  6. Üreticinin talimatlarına göre DNA Temiz ve Konsantratörü-5 Seti (Zymo Araştırma) ile Cy3 etiketli örnek temizleyin. 12 mcL Zehir.

5. Hibridizasyon için Virochip Mikroarray

  1. İsteğe bağlı: (numune normalleşmesi için), Nanodrop spektrofotometre dahil cDNA konsantrasyon ve boya miktarını kontrol 1.5 mcL
  2. 1 mcL 25X parçalanma tampon, 5 mcL 5X engelleme tampon, 9.5 mcL Cy3-etiketli örnek (veya normale miktarı), su ve PCR şeridi tüpü 25 mcL toplam hacmi (Agilent) eklemek
  3. 2X GEX hibridizasyon tamponu (Agilent) 25 mcL ekleyin. Kabarcıkları kısaca aşağı spin.
  4. Conta slayt üzerine numune 40 mcL yükleyin.
  5. Place Agilent baskılı Virochip array (Californi Üniversitesi, San Francisco / Agilent) (aşağı "Agilent" işaretli tarafı) ve conta slayt üst sıkıca vidayı sıkın.
  6. 65 gecede melezleşme ° C fırında 10 devirde hız ayarı.
  7. 37 ° C'ye kadar diziler, ön ısıtma ve ön tampon 2 (Agilent) yıkamak için Tampon 1 (Agilent) conta slayt / dizi sandviç sualtı ayrı ele alalım. Tampon 1 x 1 dakika yıkayın. Önceden ısıtılmış tampon 2 x 1 dakika yıkayın. Yavaş yavaş, kabarcıkları önlemek için dikkatli olmak (kimwipe uzakta doğrudan dizi aktif yüzlerine dokunmaktan kaçınmak için dikkatli olmak ekstra nem fitil kullanın), tampon 2 slayt kaldırmak
  8. Slayt slayt tutucunun içine yerleştirin ve dizi tarayıcı takın.

6. Virochip Tarama ve Analizi

  1. Tarama Cy3 etiketli dizi araç standart tarama protokolü (Şekil 2B) göre 5 mm veya 2 mm.
  2. Virochip mikroarray'ler görsel denetim, kümeleme analizi, ya da otomatik Virochip analiz programı tarafından analiz, 11 E-tahmin edin . Bu üç yöntemin her biri tarafından, grip virüsü burun sürüntü örneği (influenza benzeri hastalığı olan bir çocuk) (Şekil 2C) kolayca tespit

7. Temsilcisi Sonuçlar:

Protokol doğru yapıldığında, bir karalama Rd B adım (Şekil 2A) sonra agaroz jel elektroforez görülebilir. Agilent platformu Virochip mikroarray (Şekil 2B) görsel olarak analiz etmek zor olacak, ama bir virüs varsa kolayca görsel denetim, kümeleme analizi, ve / veya E-Tahmin (Şekil 1C) tespit edilmelidir. Tayini için bir pozitif kontrol olarak hizmet; Numuneler bilinen bir virüs (MS2 bakteriyofaj örneğin tütün mozaik virüsü) nükleik asit ölçülen miktarları ile çivili olabilir.

figure-protocol-1
Şekil 1. Virochip mikroarray işleme ve analiz şematik klinik örneklerden nükleik asit Çıkarılan rastgele amplifiye floresan boya ile işaretlenmiş ve Virochip mikroarray için melezleşmiştir. Mikroarray'ler 2 mikron çözünürlükte taranır ve E-tahmin de dahil olmak üzere, çeşitli hesaplama araçları kullanılarak analiz edildi.

figure-protocol-2
Şekil 2. Virochip tayininde Adımlar amplifikasyon sonra rastgele PCR, bir karalama 200 - 1000 bp jel elektroforezi ile görüntülendi (A) (B) Üç Virochip mikroarray'ler 8 diziler / cam slayt küçük bir bölge ile gösterilir. (C) sağ alt köşesinde, içeride havaya uçurulan bir mikroarray Otomatik mikroarray viral analizi ile klinik örnek, influenza A virüsünün varlığını gösteren E-tahmin edin. Yüksek benzerlik skoru (s = 0.55), bu nedenle bu son derece önemli bir tahmin yapmak, sıfıra yakın bir p-değeri karşılık gelir.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virochip protokolü burada açıklandığı gibi karmaşık ve yetenekli ve titiz bir araştırma teknisyeni gerektirir. Doğru reaktif konsantrasyonu ve PCR etiketleme koşulları ve hibridizasyon kritik öneme sahiptir. Virochip protokolü nükleik asit ekstraksiyon TRIzol (Invitrogen) gibi bir doku çıkarma yönteminin kullanımı ile hastalıklı dokuların analizi kolayca uyum sağlamak için değiştirilebilir. Problar eklendi veya istenen spektrumu ve kapsamının genişliği elde etmek için gerekli silinmiş olabilir, örneğin "-the-fly", bakteri ve mantarlar gibi nonviral hedeflerin saptanması için yoklamaları dizayn edilebilir ve ekledi. Henüz geliştirme aşamasında Virochip testinin bazı uygulamalar, klinik laboratuvar, salgın araştırma, saflık taraması, ilaç ve aşılar ve yeni viral patojen keşif geniş spektrumlu bir viral teşhis içerir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Virochip protokolün ilk geliştirme ve optimizasyonu için David Wang, Anatoly Urisman Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, ve Alexander Greninger teşekkür ederim. Bu çalışma bir NIH K08 hibe ve Abbott Keşif Ödülü (CC) ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü (JLD) tarafından desteklenmektedir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif / malzeme Adı Reaktif / malzeme Adı
Primera 5'-GTTTCCCAGTCACGATA (N9) -3 '
Primer B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '
RT Master Mix (5 mcL) 2 mcL 5X RT tampon
1 mcL 12.5 mM dNTP (Invitrogen)
1 mcL su
0.5 mcL 0.1M DTT
0.5 mcL SSIII RT (Invitrogen)
Sequenase Mix (5 mcL) 1 mcL 5X Sequenase tampon
3.8 mcL su
0.15 mcL Sequenase (USB Corporation'ın)
Rd B PCR Master Mix (45 mcL) 5 mcL 10X PCR buffer
1 mcL 12.5 mM dNTP (Invitrogen)
1 mcL 100 mcL / B pmol astar
1 mcL KlenTaq LA (Sigma)
37 mcL su
Rd C PCR Master Mix (45 mcL) 5 uL 10X PCR buffer
1 mcL 12.5 mM dNTP (Invitrogen)
1 mcL 100 mcL / B pmol astar
1 mcL KlenTaq LA (Sigma)
37 mcL su
Hibridizasyon tamponu (25 mcL) 1 mcL 25X parçalanma tampon (Agilent)
5 mcL 5X engelleme tamponu (Agilent)
Cy3-etiketli örnek (veya normale miktarı 9.5 mcL)
25 mcL toplam hacim su ekleyin.
Agilent Virochip mikroarray Chiu laboratuvar, UCSF edinilebilir; bekleyen lisans

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).
  2. Chiu, C. Y. Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray. J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).
  3. Chiu, C. Y. Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult. Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).
  4. Chiu, C. Y. Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children. J Pediatr. 153, 76-83 (2008).
  5. Kistler, A. Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).
  6. Rota, P. A. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science. 300, 1394-1399 (2003).
  7. Wang, D. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).
  8. Urisman, A. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).
  9. Kistler, A. L. Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent. Virol J. 5, e25-e25 (2008).
  10. Chiu, C. Y. Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).
  11. Urisman, A. E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns. Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Viral Pathogen DetectionVirochip MicroarrayNucleic Acid ExtractionRandom Primer PCRFluorescent Dye LabelingMicroarray HybridizationAgilent ScannerClinical Sample AnalysisBroad Spectrum SurveillanceNovel Virus Discovery

Related Articles