Değerlendirmek için In vivo Etkileri, kas hastalıkları için tedavi edici girişimlerin yöntemleri tedavi edilen kas kuvvet üretimi ve yorulabilirlik ölçmek için ihtiyaç vardır. Biz ayrıntılı eksplante fare hindlimb kas myo-mekanik özelliklerini değerlendiren bir yaklaşım. Bu analiz, kas fonksiyonu genetik değişiklik, kas hastalığı fare modelleri tedavilerin yanı sıra karşılaştırma etkileri quantitating için sağlam bir yaklaşım sağlar.
Yöntem makalesi
İzole İskelet Kası Myo-mekanik Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
1,2,3 kas hastalığının tedavisi için terapötik girişimlerin in vivo etkileri değerlendirmek için, kantitatif yöntemlere ihtiyaç tedavi kas kuvvet üretimi ve yorulabilirlik önlem. Biz fare taze eksplante hindlimb kas myo-mekanik özelliklerinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir yaklaşım açıklar. Kullanarak, maksimum seğirme ve tetanik gerginlik, kasılma süresi, ve yarım gevşeme zamanı ölçme; kas kas şeridi myograph (Danimarka Myo Teknoloji Model 820MS) montaj, fare ekstansör digitorum longus kas atravmatik hasat tarif kare dalga Stimülatörü (Model S48, Çim Teknolojileri). Bu ölçümler kullanılarak, kas kesit alanı, seğirme-tetanik gerilim oranı, kuvvet-frekans ilişkisi eğrisi ve düşük frekanslı yorgunluk eğrisi 4 normalize özel seğirme ve tetanik gerilim hesaplama göstermektedir. Bu analiz, tedavi fare modelleri, kas hastalıkları 1,2,3,5 müdahalelerin yanı sıra, kas fonksiyonu 6,7,8,9 genetik modifikasyon etkilerinin karşılaştırılması arasındaki sayısal karşılaştırma için bir yöntem sağlar .
Protokol
Protokol UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) onayı ile yapılır.
1. Fare ekstansör digitorum longus (EDL) kas diseksiyonu
- Kurumsal kurallarına uygun olarak tüm hayvan işlemleri gerçekleştirin.
- 10 kas hasattan hemen önce 200 mg / kg intraperitoneal / pentobarbital servikal dislokasyon ile hayvan Euthanize. Diseksiyonu iyi ötenazi 15 dakika içinde kas hasat ve gerilim dönüştürücü monte edilebilir şekilde uygulanmalıdır.
- Diseksiyonu tepsisi ve tepsiye pin bacak karkas yatar düzenleyin.
- EDL (Fig.1B) ayak bileği diseksiyon mikroskobu, açık cilt, dikkatli bir şekilde açık fasya (Fig.1A), ve kabuğu tibialis altında açığa çıkarmak için yukarı. Kas nemli ve hasat sırasında tamponlu tutmak Laktatlı Ringer solüsyonu damla kullanın.
- Her iki ucunda, mümkün olduğu kadar çok tendon olarak koruyarak, EDL çıkarın ve Laktatlı Ringer çözeltisi içeren Petri koymak. Kravat dikiş her kas tendon (Fig.1C). Bu kas lifleri dokunulduğunda veya diseksiyon sırasında rahatsız edilmemesi esastır.
2. Kas Şeridi'nde Myograph Fare EDL montajı
- Bu çalışmalar için, bir doku banyosu sürekli oksijenasyonu ile sabit sıcaklıkta fizyolojik çözüm yıkanmasına izin verirken kas güvence altına ihtiyaç vardır. Banyo, kas gerginliği ölçümü için bir güç dönüştürücü ile birleştirilmiştir. Biz bu amaç için Danimarka Myo Teknolojisi (DMT Model 820MS) entegre bir kas şeridi myograph banyo kullanırlar. Buna ek olarak, bir kare dalga, elektrik stimülatörü (Grass Model S48) ve veri toplama platformu (ADInstruments PowerLab Veri Toplama Sistemi ve LabChart yazılım), sırasıyla, myo-mekanik yanıtları kaydetmek ve analiz ortaya çıkarmak için ihtiyaç vardır. DMT 820MS kas şeridinin orta kısmı, kas iki tarafında konumlandırılmış bölmesi kapağı, entegre platin elektrotlar vardır. Diğer myographs elektrot yerleştirme için özel dikkat gerektirebilir.
- 5 ml Krebs Henseleit solüsyonu 11 ile myograph banyo doldurun. 25 ° C sıcak Kullanmadan önce 15 dakika boyunca banyo ile Bubble O 2 / CO 2 (% 95 /% 5).
- Myograph, kelepçeler arasında EDL genişletmek ve kelepçeler arasında EDL kas ve tendonların (Fig.1D E) güvence altına almak için dikişlerle kullanın. Kas kendisine kelepçe için dikkatli olun.
- 25 myograph banyo koruyun ° C.
3. Myo-mekanik Analizi
A. Twitch gerginlik
- Banyo ilk uzunluğu, kas gevşekliği olacak şekilde ayarlayın.
- Sonra maksimal seğirme gerilim elde etmek için gerilimi ayarlayarak maksimum uyaran (süresi 0,5 ms) belirleyin,% 20 maksimum (supramaksimal uyaran ulaşmak için) uyaran ayarlanır. Çalışmalarda, supramaksimal uyaran genellikle 40 volt bir çıkış elde edilir.
- Stimülatörü bir osiloskop kullanarak çıkış olun.
- Seğirme gerginliği daha fazla bir artış kalmayıncaya kadar kademeli olarak kas germe optimal uzunluğunu belirlemek.
- 3 dakika kas denge izin ver.
- Çim S44 elektronik stimülatör kullanarak optimum uzunlukta supramaksimal kare uyaran (0.5 ms) ve kayıt çıkış sunun.
- Kayıt: seğirme gerilim eğrisi (P t-zaman; Fig.2A).
B. Tetanoz gerginlik
- Kas 3 dakika dinlenmek için izin ver.
- Çim S44 elektronik stimülatör kullanarak optimum uzunlukta 150 Hz 300msec supramaksimal uyaranlara tren, ve kayıt çıkış uygulayın.
- Rekor: tetanoz gerilim eğrisi (P o-zaman; Fig.2B).
C. Force frekans
- Kas 3 dakika dinlenmek için izin ver.
- Kuvvet-frekansı: her uyarıcı (Şekil 3) arasında kalan 3 dakika ile 30, 60, 100, 140, ve 160 Hz supramaksimal uyaranların trenlerde geçerli. Alternatif olarak, tren, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 ve daha düşük frekanslarda daha iyi çözünürlük için 160 Hz kuvveti değişiklikler büyük ölçüde uygulanabilir.
- Konu: kuvvet-frekans ilişkisi (% maksimal kuvvet vs stimülasyon frekansı).
D. Yorgunluk
- 10 dakika için 300 ms (veya% 50 maksimum kuvvet üretmek için ayarlanabilir frekans), her 3 saniyede 60 Hz kısa tetani tren uygulayın. 10 dakika, tetanik kuvvetin başlangıç değeri (Şekil 4) ~% 15 oranında bir plato seviyesine inmesi gerekir.
- Konu: düşük frekans yorgunluk (% maksimal kuvvet-zaman).
E. protokol sonunda Ek veri toplama
- Myograph kas nasıl açıp kapayabilirsiniz önce musc ayarlamakle adım III.A.4 belirlenen optimal uzunlukta ve mikroskop veya kaliperler ile ya bir göz kullanarak kendi çapını ölçün. Kesit alanı (mikron 2) hesaplayın.
- Sütür kaldırılması ve tartım kas kas kütlesi (mg) ölçün.
- Vücut kütlesi (gr) değerlendirmek için fare tartılır.
4. Hesaplamalar
- Muscle: vücut kütle oranı =
kas kütlesi / vücut kitle - Twitch gerginlik, P t (MN) =
seğirme sırasında oluşan maksimum gerilimi - Özgül seğirme gerginliği (N / cm 2) =
seğirme gerilimi (mN) / kesit alanı (mikron 2) x 10 5 N / mN • mikron 2 / cm 2 - Pik gerilimi Süresi (ms) =
maksimum gerilim daralma başlaması zaman - Half-gevşeme zamanı (ms) =
pik gerilimi tepe gerilim% 50 zaman - Tetanik gerginlik, P O (MN) =
tetanoz sırasında oluşan maksimum gerilimi - Özel tetanik gerginliği (N / cm 2) =
tetanik gerilimi (mN) / kesit alanı (mikron 2) x 10 5 N / mN • mikron 2 / cm 2 - Tetanoz yükselişi maksimal hızı (KB / s) =
tetanoz, yani tetanik gerilim eğrisi (veya dP O / dt) maksimum eğim gerginlik yükselişi sırasında gerginlik artışı maksimum hızı - Half-rahatlama tetanik gerilimi (ms) =
stimülasyon bırakma stimülasyon bitiminde gerginlik% 50 zaman - Twitch gerilim-tetanik gerilim oranı, P t / P O =
maksimum seğirme gerilim / maksimum tetanik gerginlik - Yorgunluk indeksi =
maksimal izometrik gerilim düşük frekanslı yorgunluk iki dakika sonra gerginlik oranı
5. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. EDL kas diseksiyonu. Hindlimb muscles.TA, tibialis anterior B, EDL (ekstansör digitorum longus) kas Pozlama, Pozlama C, EDL tendonları sütür Ek D, Gerilim transdüser banyo (yandan görünüm) E, EDL banyo monte (üstten görünüm). Kas eksik amaçlıdır tampon dalmış, pratikte, kas tamamen kurumasını önlemek için dalmış olmalıdır.
Şekil 2. Örnek gerilim eğrileri. Seğirme gerilim eğrisinin maksimum seğirme gerilimi (P t), kasılma süresi (BT) ve yarı-gevşeme zamanı (HRT) gösteren A, Örnek Bar, 1s B, maksimal tetanik gerginlik gösteren tetanik gerilim eğrisi (P o) Örnek ve yarım rahatlama tetanik gerilimi (HRTT). Bar, 1s.
Şekil 3. Örnek, kuvvet-frekans ilişkisi analizi . Artımlı stimülasyon frekansları tarafından oluşturulan bir Gerginlikler B, 30MHz puls Örnek Bar, 80ms C, 140MHz puls örneği. Bar, 80ms D, A gösterilen veri elde edilen kuvvet-frekans eğrisi örneği. Kuvvet-frekans eğrisi şekli kas gücü karakteristik ve farklı hayvanların kasları arasında mukayese edilebilir.
Şekil 4. Düşük frekanslı yorgunluk analizi örneği. , Belirtilen zaman noktalarında (B, C, D) nabız trenler düşük frekanslı stimulation.Examples süre içinde oluşturulan, azalan gerilimleri aşağıda gösterildiği E, A gösterilen veri elde edilen düşük frekanslı yorgunluk eğrisi örneği . Düşük frekanslı yorgunluk eğrisinin şekli kas gücü karakteristik ve farklı hayvanların kasları arasında mukayese edilebilir.
Tartışma
Biz fare eksplante hindlimb kas myo-mekanik özelliklerinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir yaklaşım açıklar. EDL, tibialis anterior kas arkasında posterior pozisyon nedeniyle incelemek için daha zor iken, tibialis anterior önemli tendinöz ekleri nedeniyle ayak bileği ve diz eklemleri daha değerlendirmek için daha kolaydır. Bu tendonlar, kas şeridi myograph montajı kolaylaştırmak. Aksine, daha kolay erişilen tibialis anterior derece zor hem kas ödün vermeden teşrih ve myograph güvenli bir şekilde monte, geniş bir diz eklemi, neredeyse atendinous eki vardır. Ayrıca fizyolojik tampon ve sıcaklık hızla oksijenli hamamı kas montaj kas mekanik özelliklerinin korunması için gerekli olduğuna dikkat çekiyor. Biz, biz, bu koşullar altında kas yanıt olarak önemli değişiklikler olmadan 30 dakika kadar bu analiz tekrarlayabilirsiniz bulduk. Sonuç olarak, kas lifleri, kas fonksiyonu üzerinde olumsuz etkileri var ve myo-mekanik güç, küçümsenmesi sonucu olarak diseksiyon ve montaj prosedürleri sırasında dokunulmaz değil esastır. Bu prosedürler izlenerek, bu analiz 6,7,8,9 kas fonksiyonu genetik modifikasyon etkileri yanı sıra, kas hastalıkları 1,2,3,5 fare modelleri terapötik müdahaleler arasında karşılaştırma değerlendirilmesi için sağlam bir nicel bir yaklaşım sağlar .
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma NHLBI PEO için Halk Sağlığı Servisi Grant (HL086513) ve Rejeneratif Tıp (RC1-00104), Kamu Sağlık Hizmetleri NHLBI Grant (HL085377) için California Institute Kapsamlı Araştırma Fonu tarafından desteklenen ve bir hediye Pollin'in Vakfı HSB
SC Kök Hücre Araştırma Ödülü San Francisco State University (TB1-01.194) bir California Rejeneratif Tıp Köprüler Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Malzemeler
Çözümler ve Medya
Ringer solüsyonu
- 100 mM NaCl
- 30 mM CH3CH (OH) COONa (sodyum laktat)
- 4 mM KCl
- 1 mM CaCl 2 2H 2 O (kalsiyum klorür dihidrat)
- 6.75 ile pH ayarı
Krebs Henseleit çözümü
- 118 mM NaCl
- 4.7 mM KCl
- 1.25 mM CaCl 2
- 1.2 mM MgCl 2
- 1.2 mM KH 2 PO 4
- 25 mM NaHCO 3
- 11 mM glukoz
- O 2 / CO 2 (% 95 /% 5) gaz ile değişikti tarafından 7,2-7,4 pH ayarı
Pentobarbital
- Steril su içinde 5 mg / ml çalışma çözüm
Kaynaklar
- Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).
- Messina, S. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice. FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).
- Danieli-Betto, D. Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue. Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).
- MacIntosh, B. R., Willis, J. C. Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).
- Hayes, A., Williams, D. A. Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming. J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).
- Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).
- Danieli-Betto, D. Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).
- Chan, S. A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).
- Personius, K. E. Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice. J Appl. , Forthcoming (2010).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).
- Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II. Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).
Yeniden basım ve izinler
