Yöntem makalesi

Egzersizle indüklenen Lenfosit Apoptoz belirlenmesi için parmak sopa Kan Örnekleme Metodolojisi

DOI:

10.3791/2595

⸱

24 Şubat 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Kinesiology, Recreation, and Sport, Western Kentucky University, 2Department of Health and Human Performance, University of Houston

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzersiz immün hücrelerinde apopitoz indükleyen yeteneğine sahiptir. Özellikle önce değerlendirilmesi için kan örneği izole etmek ve tedavi etmek için gerekli süreyi ile ilgili çeşitli ölçüm sınırlamaları vardır. Göstermiştir egzersize bağlı lenfosit apoptozis analizi için hızlı ve minimal invaziv bir işlemdir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzersiz bağışıklık hücrelerinin apoptozisi indükleyen yeteneğine fizyolojik bir uyarı. Bugüne kadar, özellikle hücre ölümü değerlendirme öncesinde kan örneği izole etmek ve tedavi etmek için gerekli süreyi ile ilgili çeşitli sınırlamalar, bu fenomenin ölçümü ile tespit edilmiştir. Bu nedenle, immün hücre apoptozis artar, sistem üzerinde egzersiz gerçek etkisi katkıda veya bu ölçüm sonunda elde etmek için gerekli zaman ve işleme bir yansıması olup olmadığını belirlemek zordur. Bu yazıda, egzersize bağlı lenfosit apoptozis analizi için hızlı ve minimal invaziv bir prosedür ortaya koymaktadır. Diğer tekniklerin aksine, tam kan, hemen bir örnek elde etmek üzerine bir antikor paneline eklenir. Kuluçka döneminin ardından, kırmızı kan hücrelerinin parçalanmış ve numuneler analiz edilecek hazırız. Bir parmak-stick örnekleme prosedürü kullanmak gerekli kan hacmini azaltır ve konulara rahatsızlığı en aza indirir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Parmak-Stick Kan Örnekleme

  1. Tam kan toplanması genellikle kesildikten sonra (genellikle 1-3 saat sırasında bazal ölçüm (genellikle 10-15 dk oturan geri kalanı aşağıdaki), veya bir egzersiz nöbeti hemen ardından, egzersiz sonrası dönem boyunca dinlenme alınır egzersiz).
  2. Evrensel Önlemler kullanarak, önce parmak ucu% 70 izopropil alkol ile sterilize edin.
  3. Sonra, delinme, otomatik bir neşter veya benzeri bir cihaz kullanarak site. Biz tabi konfor sağlamak için 30-gauge neşter kullanmalarına rağmen, daha büyük bir iğne yararlanılabilir.
  4. Ilk kan damlası uzak silin ve sonra da kan pıhtılaşmasını önlemek için lityum heparin ile tedavi, kılcal tüpler veya microvettes içine toplamak.

2. Hücre fenotipleme ve Apoptoz Boyama

  1. 250 mcL bağlayıcı tampon titred antikor paneli (bkz. Tablo 1 şematik) 10 mcL heparinize tam kan ekleyin. Biz başarı ile 1:20 seyreltme faktörü var, ama her laboratuar için en iyi çalışma çözümü belirlemek için reaktifler titre.
    (Tablo 1). Lökosit altkümelerini egzersiz apoptosis belirlenmesi için antikor paneli. Geç apoptozis Annexin V ve 7-AAD çift pozitif etiketleme tarafından tanımlanan iken erken apoptozis, Annexin V ifadesi ile tanımlanmıştır. V-7-AAD + hücreler nekrotik hücreler Annexin edildi.
    Tüp 1 Tüp 2 Tüp 3 Tüp 4
    Hücreler sadece tüp Annexin V - FITC Annexin V - FITC Annexin V - FITC
    Anti İnsan CD4-PE Anti İnsan CD8 - PE Anti İnsan CD19-PE
    7-AAD 7-AAD 7-AAD
    Anti İnsan CD45RA - APC Anti İnsan CD45RA - APC

    7-AAD = 7-Amino-aktinomisin D, APC = Allophycocyanin, CD4 yardımcı T lenfositler, CD8 = Bastırıcı / sitotoksik T lenfositler, CD19 = B lenfositleri, CD45RA = naif hücre alt grupları, FITC = Floresein izotiyosiyanat, PE = Fikoeritrin.
  2. Karanlık oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  3. 5-10 dakika 1075 xg'de santrifüjleyin.
  4. Durusu, 300 mcL Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tampon ekleyin ve iyice girdap.
  5. 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  6. RBC parçalama reaksiyonu durdurmak için 300 mcL PBS ekleyin.
  7. 5-10 dakika 1075 xg'de santrifüjleyin.
  8. Durusu, raf ve 50 mcL bağlayıcı tampon ekleyin.
  9. Flow sitometri ile analiz edin.

Sadece tüp arka plan otofloresans saptanmasında bir negatif kontrol olarak hizmet etmek için bir hücre, her bireyin içeren tüplere ve akış sitometresinin ilk sırasında tazminat ayarlamak için florokrom: en azından aşağıdaki denetimleri kullanılan olması tavsiye edilir. Buna ek olarak, bizim deneyler kurmak için tazminat standart boncuk başarıyla kullanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minimal invaziv bir örnek toplama işlemi ve sonraki analiz egzersize bağlı lenfosit apoptozis hem erken ve geç faz analizi için gösterilmiştir. Bu açıkça nekrotik ve apoptotik değil bu hücrelerin, dışlamak için de mümkündür. Bu işlem sırasında, önce birden fazla zaman noktalarında antekübital bölgede invaziv venipunktür ile ilgili sakıncaları ve rahatsızlık üstesinden ve egzersizden hemen sonra ya da egzersiz maçın süresi için bir kateter güvence. Araştırmacılar açısından, bu tür işlemler genellikle flebotomi, tüm birey...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Western Kentucky Üniversitesi'nde Fakülte Burs Konseyi Yeni Bir Fakültesi Grant tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Akış Sitometrisi Bağlayıcı TamponeBioscience00-4222-26
RBC Lizis TamponueBioscience00-4333-57
Lancet CihazıAccu Check Soft TouchRoche Group
Kılcal tüplerHeparinize Kılcal TüplerChase Scientific Glass, Inc.501
SantrifüjGmC LaboratuvarıGilson, Inc.PMS-880
Annexin V-FITC KonjugeBiyovizyon A.Ş.K201-400-1
CD4-PE KonjugeAnti-insan, klon RPA-T4eBioscience12-0049-42
CD8-PE KonjugeAnti-insan, klon OKT8eBioscience12-0086-73
CD19-PE KonjugeAnti-insan, klon HIB19eBioscience12-0199-42
7-AAD Canlılık Boyama ÇözeltisieBioscience00-6993-50
CD45RA-APC KonjugeAnti-insan, klon HI100eBioscience17-0458-42
Akış sitometresiC6Accuri

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
  2. Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
  3. Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
  4. Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
  5. Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
  6. Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
  7. Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ak SitometrisiEritrosit LizisiAnnexin V BoyamaEgzersize Ba l ApoptozTam Kan AnaliziLenfosit Alt FraksiyonlarKapiller T p rneklemesiAntikor Paneli nk basyonu

İlgili makaleler