Bir göstermektedir. In vivo Retina ganglion hücrelerinin (RGCs) ve geniş bir yaş aralığı üzerinde postnatal farelerde diğer retinal hücre tipleri, tek ya da küçük kümeler transfecting elektroporasyon protokolü. Etiket ve genetik postnatal RGCs işlemek için yetenek In vivo Gelişim çalışmaları için güçlü bir araçtır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon
Bu makalede
Özet
Özet
Ortabeyin RGC projeksiyonlar hedefleme ve arıtma gelişimi sırasında nöral bağlantı formunun ne kadar hassas desenler çalışmak için popüler ve güçlü bir model sistem. Farelerde, retinofugal projeksiyonlar, talamus ve Superior Colliculus (SC) Lateral genikulat Nucleus topoğrafik bir şekilde ve form göz belirli katmanlarına (dLGN) düzenlenir. Retinofugal projeksiyonlar bu kesin desen gelişimi genellikle horseradish peroksidaz 1-4 gibi floresan boyalar ve izleyiciler ile RGCs nüfusu, etiketleme çalışılmıştır. Ancak, bu yöntemler retinotopic harita oluşumunun temelinde bireysel RGC aksonal çardak morfolojisi gelişimsel değişiklikler içgörü sağlamak için çok kaba. Ayrıca RGCs genetik manipülasyon için izin vermez.
Son zamanlarda, elektroporasyon 5-11 retina içine yüklü moleküllerin teslimat için mekansal ve zamansal hassas kontrolü sağlamak için etkili bir yöntem haline gelmiştir. Şu retina elektroporasyon protokolleri genetik manipülasyon için izin ve doğum sonrası farelerde RGCs, tek ya da küçük bir kümenin retinofugal projeksiyonları izleme yok. In vivo elektroporasyon postnatal RGCs transfecting etiketleme verimliliği son derece düşük olduğu için uygulanabilir bir yöntem değildir ve bu nedenle embriyonik yaşta RGC atalarıdır farklılaşması ve proliferasyonu 6 geçiren hedef gerektirir öne sürülmüştür .
Bu video için in vivo elektroporasyon protokolünde hedeflenen gen teslimat, shRNA ve postnatal fare RGCs floresan dextrans açıklar. Bu teknik, dallanma, laminasyon, yenilenme ve devre geliştirme çeşitli aşamalarında sinaps oluşumu, akson retraksiyon da dahil olmak üzere sinirsel gelişimi çeşitli yönleri yer alan aday genlerin etkin bir tarama için hızlı, etkin maliyetli ve nispeten kolay bir platform sağlar. Özet olarak biz burada duyusal harita gelişiminin altında yatan moleküler mekanizmaları içine daha fazla bilgi sağlayacak değerli bir araç açıklar.
Protokol
1. Set-up Elektroporasyon için ekipman
- Elektrotlar: Biz Dumont elektrotlar olarak kullanmak için # 5 forseps güncellenmiştir.
- Ayrı ve forseps parçalayın.
- Lehim her dişine daha geniş sonunda bir tel. Tel bağlanmış ve yalıtım bandı ile dişleri maruz çatallı ucu yaklaşık 25-30 mm bırakarak sarın.
- Modifiye forseps bahar eylem sağlamak için uygun plastik iki dişleri arasında herhangi bir boşluk (örneğin, bir düğme) ile tekrar bir araya koyun.
- Elektrik donatımı: Biz, teslim olmak bakliyat dalga ve numarayı onaylamak için elektroporasyon ve osiloskop ve ses monitör için geçerli bakliyat sunmak içi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu video in vivo elektroporasyon protokol gösteren floresan proteinleri kodlayan DNA yapıları ile doğum sonrası farelerde retinal nöronların tek ya da küçük kümeler etiketlenmesi ile sonuçlanır. Önceki çalışmalarda bu elektroporasyon normal RGC akson çardak arıtma karışmadı gösteren, lipofilik boyalarla RGC etiketleme kullanarak dLGN ve SC floresan etiketli RGC projeksiyonları Küçük kümeler benzer projeksiyon modelleri çoğaltılamaz. Biz, normal ve kesintiye görsel haritalar ile çeşitli fare modelleri tek ve RGC.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
PCAG gapEGFP plazmid Dr. S. McConnell (Stanford, CA) bir hediye oldu. pCAG-tdTomato plazmid Dr. M. Feller (Berkeley, CA) bir hediye oldu. Biz, teknik destek için pilot çalışmalar ve Crair laboratuvar üyeleri iki plazmid Cre / loxP strateji doğrulamak için tek bir hücre etiketleme ve Anne Schohl (Montreal, QC) için iki plazmid strateji kullanımı öneren Dr. Edward Ruthazer teşekkür ederiz. R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) ve NIH P30 EY000785 (MC) ile desteklenir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Malzemeler | Şirket | Katalog numarası | |
| Dumont # 5 Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11252-20 | |
| Elektrik Stimülatör | Çim Aletleri | Model S4 | |
| Osiloskop | Agilent | Model 54621A | |
| Ses monitör | Çim Aletleri | Model AM8B | |
| Çektirme | Sutter Aletleri | Model P-97 | |
| Vannas Makas bir | Dünya Hassas Aletler | 14003 | |
| Mikro Makas b | Ted Pella | 1347 | |
| Dumont AA Forseps c | Güzel Bilim Araçları | 11210-20 | |
| II Sistem Nanoinject | Drummond Bilimsel | 3-000-204 | |
| Cam Pipetler | Drummond Bilimsel | 3-000-203-G / X | |
| Ayak pedalı | Drummond Bilimsel | 3-000-026 | |
| Madeni Yağ | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DII | Invitrogen | D-383 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
Kaynaklar
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
