Method Article

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

DOI:

10.3791/2809

⸱

August 5th, 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics and Department of Cancer Biology, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğrudan taze hasat fare kemik iliği, dalak veya fetal karaciğer farklılaşma aşamalı özel fare eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve moleküler analiz için bir akış sitometri yöntemi. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 ve hücre boyutu dayanır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eritropoez çalışmada, kırmızı kan hücrelerinin erken hematopoetik ve eritroid atalarıdır nasıl şekillendiğini anlamak hedefliyor. Özellikle kırmızı hücre oluşumu oranı sentezi, doku hipoksisi tarafından tetiklenir eritropoietin hormonu (EPO), tarafından düzenlenir. Epo hızlı bir artış yeterli oksijenlenme sonuçları, eritropoetik oranı artış sürüş için bir tehdit, eritropoetik stres yanıtı olarak bilinen bir süreçtir. Dolaşımdaki kırmızı hücrelerin sayısında artış dokuya oksijen taşınmasını artırır. Bu nedenle, verimli bir eritropoetik stres yanıtı yüksek irtifa, anemi, kanama, kemoterapi ya da kök hücre nakli gibi fizyolojik ve patolojik koşullarda hayatta kalma ve kurtarma için kritik öneme sahiptir.

Fare eritropoezi çalışma ve stres yanıtı için önemli bir model. Fare kesin (erişkin tip) eritropoezi yenidoğan dalak, ve yetişkin dalak ve kemik iliği, fetal karaciğer embriyonik gün 12,5 ve 15,5 arasında yer alır. Dokusunda eritroid atalarıdır Klasik yöntemler, kırmızı hücre kolonileri Epo içeren yarı-katı medya kaplama yol vermek için bu hücrelerin yeteneği güveniyor. Onların eritroid prekürsör döl morfolojik kriterlere göre tespit edilir. Ne bu klasik yöntemlerle moleküler çalışma için farklılaşma aşamalı özel eritroid hücreler çok sayıda erişim sağlar. Burada doğrudan taze izole fare doku bağlamında farklılaşma aşamalı özel eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve eğitimi bir akış sitometri yöntemi mevcut. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 dayanmaktadır ve akış sitometrik 'ileriye dağılım' parametre, hangi hücre büyüklüğünün bir fonksiyonudur. CD71/Ter119 testi in vivo eritropoetik strese tepki sırasında eritroid atalarıdır çalışma için kullanılabilir, örneğin, anemik fare ya da fare düşük oksijen koşullarında ev sahipliği yapmaktadır. Ayrıca eritropoezi değiştirilmiş moleküler yolun belirli bir rolü değerlendirmek üzere, eritroid, genetik olarak değiştirilmiş yetişkin fareler ya da embriyoların dokularda doğrudan atalarıdır çalışma olabilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dokuların hasat

  1. 2 ila 5 ml soğuk boyama tamponu (salin (PBS)% 0,2 BSA ve 5mM glikoz fosfat tamponlu) içeren tüplere hazırlayın. Doku hasat öncesi buz üzerinde tüpler tutun.
  2. Cull fareler uygun onaylanan protokole göre (örneğin CO 2 inhalasyon servikal dislokasyon takip).
  3. EDTA veya heparin kan toplama tüpleri içine kalp ponksiyon daha sonra analiz, hematokrit örneğin, retikülosit sayımı veya CBC analizi için kan çizin.
  4. 1. adımda hazırlanan ayrı bir tüp, her bir fare doku yerleştirerek, dalak ve kemik Hasat. Dalak kolay erişim sol tarafında. Kemik iliği, hasat biri veya her ikisi femur. Hasat doku buz üzerinde tutun....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akış sitometri yöntemi, hücre yüzey belirteçleri, protein ekspresyonu, hücre sağkalım, fosfor-spesifik antikorların 3 ve hücre döngüsü durumu kullanarak hücre sinyalizasyon dahil olmak üzere bir floresan konjuge spesifik antikor veya ligand, ile tespit edilebilir herhangi bir hücresel fonksiyonları eş zamanlı olarak soruşturma sağlar. Bu ölçümler, taze izole eritropoetik doku bağlamında, farklılaşma aşamasında belirli alt kümelerini bir dizi her yapılabilir. Bu yöntem, bu nedenle eritropoetik uyaranların geni.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi IACUC komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz UMass flow sitometri çekirdek teşekkür ederim: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu ve Tammy Krupoch. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü / NHLBI RO1 HL084168 (MS) ve NIH CA T32-130.807 (JRS) tarafından finanse edildi. Diyabet Endokrinoloji Araştırma Merkezi hibe DK32520 tarafından desteklenen temel kaynakları da kullanılmıştır.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktifin Adı Şirket Katalog numarası
FAS-biotin BD Pharmingen 554256
Streptavidin APC Moleküler Probları S868
40 mikron steril hücre süzgeç Fisherbrand 22363547
FACS boyama için polistiren yuvarlak alt tüpler BD Falcon 352008
U-bottom 96 plaka BD Falcon 353910
ChromePure Tavşan IgG Jackson ImmunoResearch 015-000-003
CD71-FITC (hisse senedi 0.5mg/ml) BD-Biosciences 553266
Ter119-PE (hisse senedi 0.2mg/ml) BD-Biosciences 553673
7AAD BD-Biosciences 559925
DAPI tozu Roche 236276
FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 BD Pharmingen 553848
FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 BD Pharmingen 553087
FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 BD Pharmingen 557396
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G ve Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 BD Pharmingen 553126
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 BD Pharmingen 553061
APC BrdU Akış kiti BD Pharmingen 557892
Annexin V-biotin BD Pharmingen 556418

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, Y. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in. 108, 123-133 (2006).
  2. Socolovsky, M. Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CD71 TER119 AssayFlow Cytometry AnalysisErythroid Progenitor IdentificationMouse Erythropoiesis StudyCell Surface MarkersForward Scatter ParameterFetal Liver IsolationBone Marrow HarvestErythroblast Maturation StagesErythropoietic Stress Response

Related Articles