Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

12.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/2813

⸱

16 Temmuz 2011

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

Bu makalede

Özet

Bir Ex vivo Protokolü açıklanan hematopoietik kök / atalarıdır olgun insan kırmızı kan hücreleri oluşturmak için. Ayrıca biz demonte transkripsiyon faktörü TAL1 birincil eritroid hücrelerde etkili bir lentiviral teslim yöntemi açıklanmaktadır. Lentivirüs aracılı gen teslim verimliliği GFP ifade virüsler kullanılarak gösterilmiştir.

Özet

Eritropoiesis hücre farklılaşması incelemek için yaygın olarak kullanılan bir model sistem. Eritropoezi sırasında, pluripotent yetişkin insan hematopoietik kök hücreleri (HKH'lerin) oligopotent progenitörlerle taahhüt öncüleri ve olgun kırmızı kan hücreleri 1 farklılaşırlar. Bu süreç, eş zamanlı olarak, diğer hücre türleri 2 için belirli genlerin bastırma soy belirli genlerin spesifik transkripsiyon faktörleri aktive sayede gen ekspresyonu, düzeyinde büyük bir kısmı için düzenlenir. Eritropoez düzenleyen transkripsiyon faktörleri ile ilgili çalışmalar genellikle farklılaşma 3-5 aşamada, bir dereceye kadar, eritroid hücreler temsil insan ve fare hücre hatları kullanılarak yapılmaktadır. Ancak dönüştürülmüş hücre hatları eritroid hücreler sadece kısmen taklit edebilir ve en önemlisi de bir anlaşılır son eritroid kaderi karşı birçok aşamalardan geçerek hücreler ilerleme olarak ortaya çıkan dinamik değişiklikleri incelemek için izin vermez. Bu nedenle, güncel bir sorun genomik ve proteomik deneyler gerçekleştirmek için yeterli miktarda farklılaşma çeşitli aşamalarında birincil HKH'lerin ve eritroid hücrelerin nispeten homojen nüfus elde etmek için bir protokol gelişme kalır.

Burada, kordon kanı, kemik iliği, veya G-CSF (leukapheresis) ile mobilize yetişkin periferik kan ya da izole edilmiştir insan hematopoietik kök / progenitör hücrelerin eritroid farklılaşma ikna etmek için bir ex vivo hücre kültürü protokolü açıklar . Başlangıçta Douay Laboratuvar 6 tarafından geliştirilen bu kültür sistemi, kemik iliği mikroçevresinin taklit etmek, mezenkimal hücreler sitokinler ve co-kültür kullanır . Bu ex vivo farklılaşması protokolü kullanarak, güçlü bir amplifikasyon eritroid progenitörlerle özel eritroid soy ve enükleasyon kırmızı kan hücrelerinin sahne için tam bir olgunlaşma yolunda farklılaşma bir indüksiyon gözlemliyoruz. Böylece, bu sistem eritroid soy boyunca hematopoietik kök hücre ilerleme olarak transkripsiyonel yönetmelik moleküler mekanizmayı incelemek için bir fırsat sağlar.

Transkripsiyonel düzeyde eritropoezi incelenmesi aynı zamanda birincil eritroid hücrelerde aşırı açık veya demonte özgü faktörler yeteneği gerektirir. Bu amaçla, bölme ve bölünen hücreleri 7 hem de verimli bir enfeksiyon için izin veren bir lentivirüs-aracılı gen dağıtım sistemi kullanır . Burada biz verimli birincil insan eritroid hücrelerde transkripsiyon faktörü TAL1 demonte mümkün olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, GFP ifade lentiviral enfeksiyon% 90 yakın bir verimlilik göstermektedir. Böylece, protokolü düzenleyici transkripsiyon faktörleri ağ kontrol eritropoezi karakterizasyonu için oldukça yararlı bir sistem sağlar.

Protokol

Bölüm I. insan hematopoetik kök/progenitör hücrelerinin ex vivo eritropoezi

1. CD34+ insan hematopoetik kök/projenitör hücrelerin izolasyonu

Hematopoetik kök hücrelerin (HSC'ler) ve erken progenitörlerin bir karışımını içeren insan CD34+ hücre popülasyonu 8, göbek kordonu kanından, G-CSF ile mobilize edilmiş periferik kandan (lökaferesis) veya kemik iliğinden toplanır (Şekil 1-Adım 1). Kordon kanı veya periferik kan kullanılıyorsa doğrudan adım 1.2'ye geçiniz. Kemik iliği kullanılıyorsa adım 1.1'den başlayınız. Reaktifler ve ekipmanlar için Tablo 1'e bakınız.

Aksi belirtilmedikçe, bu adım steril koşullar altında (örneğin steril kabin) ve RT'de gerçekleştirilir.

  1. Kemik iliğinden tek hücre süspansiyonu hazırlayın:
    1. İliği, %0,02 kollagenaz B ve 100 U/ml DNaz 1 içeren 10 hacim RPMI 1640 içerisinde yeniden süspanse edin.
    2. Bir balans çalkalayıcıda 45 dakika boyunca nazikçe karıştırın.
    3. Hücreleri 30μm'lik bir naylon süzgeçten filtreleyin.
  2. Ficoll yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile düşük yoğunluklu mononükleer hücreleri (MNC'ler) izole edin:
    1. Kan veya ilik süspansiyonunu, %2 fetal bovine serum (FBS) ve 2mM EDTA içeren PBS ile 2-4 hacim oranında seyreltin. Not: Daha yüksek hacimler, mononükleer hücrelerin (MNC'lerin) saflığını artırır.
    2. 50 ml'lik konik bir tüp içinde, 35 ml seyreltilmiş hücre süspansiyonunu 15 ml Ficoll-paque üzerine dikkatlice katmanlandırın. Frensiz, salınımlı kova (swinging-bucket) rotorlu santrifüjde 400g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin.
    3. Ara MNC tabakasını bozmadan üst tabakayı aspire edin.
    4. (MNC'leri içeren) ara faz tabakasını yeni bir 50 ml'lik konik tüpe aktarın.
    5. Bu tüpü doldurmak için %2 FBS ve 2 mM EDTA içeren PBS ekleyin, tüpü ters çevirerek nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300g'de santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırın.
    6. Trombositleri uzaklaştırmak için hücre peletini 2 kez daha yıkayın. Not: Bu adım, CD34 saflığını artırır.+ hücreler
    7. 20 μl hücre süspansiyonu alarak bir eppendorf tüpüne yerleştirin. 200 μl Eritrosit Lizis Tamponu (Tablo 1) ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin. Bu süspansiyondan 18 μl'yi bir hemositometreye yerleştirin ve çekirdekli MNC'leri sayın.
    8. MNK'lar hemen kullanılabilir veya -10°C'de dondurulabilir8 %10 DMSO içeren hücre kültür ortamında hücre/ml ve sıvı azotta saklanmış.
  3. CD34 İzole Etme+ pozitif immünomanyetik seçilim yoluyla hücreler (Şekil 1-Adım 1)
    CD34 Microbead Kit'i (monoklonal fare human CD34 antikorlarına konjuge Microbead'lerden oluşan bir çözelti ve human IgG içeren bir FcR Bloklama Reajeni çözeltisi), iki adet LS Mini-Macs kolonu, autoMACS Çalıştırma Tamponu ve bir MiniMACS Ayırıcı ile birlikte kullanıyoruz (Tablo 1). Aşağıda, 2,3x10 ile başlayan protokolümüzü açıklıyoruz8 MNK'ler. Farklı hücre sayıları kullanıldığında, hacimler buna göre artırılmalı veya azaltılmalıdır. Ek olarak, 2x10'a kadar8 MNC'ler için LS MiniMacs kolonu yerine MS MiniMacs kolonu kullanılabilir.
    Antikorların hücre yüzeyinde kümelenmesini ve spesifik olmayan hücre etiketlemesini önlemek için hücreleri ve reaktifleri soğuk (4-8°C) tutun.
    1. 2,3x10 içeren peleti yeniden süspande edin8 MNC'ler 690 μl Koşu Tamponu (her 10⁸ MNC için 300 μl, burada 300 μl gereken minimum süspansiyon hacmidir) içinde süspanse edilir ve 15 ml'lik konik tüpe aktarılır.
    2. 230 μl FcR Bloklama Reaktifi ekleyin
    3. 230 μl CD34 MicroBeads solüsyonu ekleyin.
    4. Elle iyice karıştırın ve 4°C'de 30 dk inkübe edin.
    5. 10 ml Çalışma Tamponu (Running Buffer) ekleyerek hücreleri yıkayın ve 300g'de 10 dakika santrifüjleyin.
    6. Süpernatantı tamamen aspire edin.
    7. Hücreleri 1,2 ml Çalışma Tamponu (Running Buffer) içinde yeniden süspande edin (her 10 için 0,5 ml tampon kullanın8 MNK'ler) Not: Manyetik ayırma işleminden önce tek hücre süspansiyonu elde etmek önemlidir. Gerekirse, hücre kümelerini gidermek için hücreleri 30μm'lik bir naylon süzgeçten geçirin.
    8. LS kolonunu, bir MiniMACS Separator'ın manyetik alanına yerleştirerek hazırlayın.
    9. Kolonu 3 ml Çalışma Tamponu ile durulayın.
    10. Kolona 1,2 ml hücre süspansiyonu uygulayın.
    11. Akış sıvısını toplayın ve bunu CD34'ün verimini ve saflığını doğrulamak için kullanın+ hücre izolasyonu. Alternatif olarak, bu fraksiyonda bulunan hücreleri dondurun ve sıvı azot içerisinde saklayın. Not: Bu fraksiyon işaretlenmemiş hücreler içerir ve ayrıca bazı işaretli CD34 hücreleri de içerebilir.+ kolona tutunmayan hücreler.
    12. Kolonu 3 ml'lik Çalışma Tamponu ile üç kez yıkayın, yıkama sıvılarını birleştirin ve bu fraksiyonu yukarıdaki akış yolu fraksiyonuna benzer şekilde kullanın.
    13. Kolonu mıknatıstan çıkarın ve 15 ml'lik polipropilen bir toplama tüpüne yerleştirin.
    14. Hücreleri elüe etmek için kolona 5 ml Koşu Tamponu ekleyin ve işaretlenmiş CD34'ü hemen yıkayarak dışarı çıkarın.+ pistonu kolona sıkıca iterek hücreleri geçirin.
    15. Hücreleri yeni hazırlanmış bir LS kolonundan geçirerek kolon saflaştırma prosedürünü (h ile n arasındaki adımlar) tekrarlayın. N.B. Bu işlem, CD34 saflığını artırır.+ hücreler. 2,3x10¹⁰'luk bir süspansiyondan8 Lökaferezden izole edilen MNC'ler ile tipik olarak 1,1x106 CD34+ belirli bir saflıktaki hücreler > %95±3 (Şekil 1-Adım 1).
    16. Hücreleri %10 DMSO içeren kültür ortamında dondurup sıvı azot içerisinde saklayın veya doğrudan 2. adıma geçin.

2. Hücre kültüründe eritroid farklılaşma

CD34+ hücreleri, 6 nolu çalışmadan uyarlanan dört aşamalı bir protokole göre (Şekil 1-Adım 2), hidrokortizonun ve spesifik sitokin kombinasyonlarının ardışık olarak eklendiği desteklenmiş IMDM ortamında kültüre edilir. Hücre büyümesini ve eritroid farklılaşmayı doğrulamak için prosedür boyunca bir dizi test gerçekleştirilir.

Bir kültürü başlatmak için gereken CD34+ hücre sayısı, deneyin ölçeğine bağlı olarak değişkenlik gösterir. Tipik olarak, gen ekspresyon çalışmaları için 10 ml besiyerinde 0.1x106 CD34+ hücre ile başlanan küçük ölçekli bir kültür yürütürüz ve prosedür boyunca fazla hücreleri dondurarak küçük hacimler koruruz. Protein ekstraksiyonunun gerektiği çalışmalar için kültürler daha büyük ölçekte gerçekleştirilir. Burada, lökaferezden izole edilen ~7x106 CD34+ hücre ile başladığımız büyük ölçekli bir deneyi tanımlıyoruz.
Süreç boyunca steril koşullar kullanılır. Reaktifler için Tablo 1, 2 ve 3'e bakınız.

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. Tablo 2'de açıklandığı şekilde takviye edilmiş IMDM besiyerini hazırlayın ve 40 ml'lik alikotları -20°C'de dondurun (önceden yapılabilir).
    2. Hidrokortizon ve sitokin stok çözeltilerini Tablo 3'te açıklandığı şekilde hazırlayın.
  2. Adım 1: Gün 0-11
    Hematopoetik hücreler; hidrokortizon (HC), kök hücre faktörü (SCF), interlökin 3 (IL-3) ve eritropoietin (EPO) içeren takviye edilmiş IMDM besiyerinde büyütülür (Tablo 3). MS-5 fare kemik iliği stromal hücreleri (Tablo 1), Adım 2'ye hazırlık amacıyla çoğaltılır.
    • Gün 0:
      1. 120 ml takviye edilmiş IMDM besiyerini önceden ısıtın ve HC, SCF, IL-3 ve EPO ekleyin (Tablo 3).
      2. Vial(ler)i önce 37°C'lik bir su banyosuna yerleştirerek 7x106 CD34+ hücreyi çözdürün. Hücreler henüz donmuş haldeyken, 1 ml önceden ısıtılmış besiyeri ekleyin ve hücreleri 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Vial'i 2 ml besiyeri ile yıkayın ve 15 ml'lik tüpe aktarın.
      3. Hücre süspansiyonuna 6 ml besiyeri ekleyin, tüpü tersyüz ederek karıştırın ve 200 g'de 5 dk santrifüjleyin.
      4. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 10 ml taze besiyerinde yeniden süspande edin.
      5. 10 μl hücre süspansiyonunu 10 μl Trypan Blue çözeltisi ile karıştırdıktan sonra yaşayan hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın (Tablo 1). Not: Çözdürme sırasında hücre ölümü yaklaşık %25'tir, bu nedenle canlı hücre konsantrasyonu ~0.5x106 hücre/ml olmalıdır.
      6. Testler için yaklaşık 3 ml hücre süspansiyonu ayırın (bkz. paragraf 6).
      7. Kalan 7 ml'yi bir T-175 flask'a aktarın ve 70 ml'de 0.05x106 hücre/ml olacak şekilde 63 ml besiyeri ekleyin; flask'ı 37°C'deki bir inkübatöre yerleştirin.
    • Gün 1:
      1. 85 ml MS-5 hücre kültür besiyerini önceden ısıtın: Glutamax içeren αMEM (Tablo 1), %10 FBS ve 100 U/ml penisilin ile 100 μg/ml streptomisin.
      2. Her birine 0.08x106 hücre/ml elde etmek için 25 ml besiyerinde 2x106 MS-5 hücresi ekilmiş üç adet 150mm x 25mm yuvarlak kültür kabı hazırlayın ve 37°C'lik inkübatöre yerleştirin. Not: En iyi sonuçlar düşük pasajlı (<20) MS-5 hücreleri kullanılarak elde edilir. Konfluen kültür, %0.05 EDTA içeren tripsin kullanılarak her üçüncü gün 1:5 oranında bölünerek genişletilmelidir.
    • Gün 2:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için hematopoetik hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücreleri (yani ~20 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Deneyimlerimize göre, ilk 2 gün boyunca hücre ölümü %30-50'yi aşabilir ve bu nedenle hücrelerin nihai konsantrasyonu genellikle Gün 0'dakine yakındır (Şekil 2).
      2. Yapışmamış MS-5 hücrelerinin uzaklaştırıldığından emin olarak MS-5 kültür besiyerini 25 ml taze besiyeri ile değiştirin.
    • Gün 4:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için hematopoetik hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücreleri (yani ~10 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Bu noktada hücreler, ~0.2x106 hücre/ml konsantrasyonda %>75 canlı hücre ile çoğalmaya başlamış olmalıdır. Hücreler, %10 DMSO içeren takviye edilmiş IMDM besiyerinde 1-2x106 hücre/ml konsantrasyonda dondurulabilir ve sıvı azot içinde saklanabilir.
      2. Kalan ~40 ml kültürü bir T-175 flask'a aktarın ve nihai hacim 150 ml olana kadar HC, SCF, IL-3 ve EPO içeren yeterli miktarda takviye edilmiş IMDM besiyeri ekleyin (Tablo 3). Not: Hücre konsantrasyonu ~0.05x106 hücre/ml olmalıdır.
      3. (%60-70 konfluen olması gereken) MS-5 hücrelerini, %0.05 EDTA'lı tripsin kullanarak yeni 150mm x 25 mm yuvarlak kültür kaplarına 1:5 oranında seyrelterek genişletin. Nihai hücre konsantrasyonu ~0.08x106 hücre/ml olmalıdır. Not: Genellikle tek bir kap 5 kez genişletilebilir, böylece ~0.08x106 hücre/ml konsantrasyonda 15 kap MS-5 hücresine sahip olmalısınız.
    • Gün 6:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için hematopoetik hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücre sayısını (yani ~5 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Hücreler yüksek proliferasyon aşamasındadır ve hücre konsantrasyonu ≤1.5x106 hücre/ml seviyesinde tutulmalıdır. Hücre konsantrasyonu daha yüksekse, HC, SCF, IL-3 ve EPO içeren taze takviye edilmiş IMDM besiyeri ekleyin.
    • Gün 7:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için hematopoetik hücreleri Trypan Blue ile sayın. Not: Deneyimlerimize göre, hücreler genellikle 7. günde 1.5x106 hücre/ml yoğunluğa ulaşır.
      2. ~0.8x106 hücre/ml hücre konsantrasyonunu korumak için yeterli miktarda besiyeri ekleyin. Not: Genellikle ~0.8x106 hücre/ml konsantrasyonda 245 ml hücre elde etmek için 100 ml taze takviye edilmiş HC, SCF, IL-3 ve EPO içeren IMDM besiyeri ekleriz.
      3. (%60-70 konfluen olması gereken) MS-5 hücrelerini, %0.05 EDTA'lı tripsin kullanarak (kaplar yerine) T-175 flask'lara 1:5 oranında seyrelterek genişletin. Nihai hücre konsantrasyonu ~0.08x106 hücre/ml olmalıdır. Not: ~0.08x106 hücre/ml konsantrasyonda 61 flask MS-5 hücresi hazırlanmalıdır. Kalan MS-5 hücrelerini dondurun ve sıvı azot içinde saklayın.
    • Gün 8:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için hematopoetik hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücre sayısını (yani ~5 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Hücre yoğunluğu ~1x106 hücre/ml olmalıdır.
      2. Sadece SCF ve EPO içeren 2L takviye edilmiş IMDM besiyerini önceden ısıtın (Tablo 2 ve 3).
      3. (~200x106 hücre içeren) 200 ml hematopoetik kültürü toplayın, 200 g'de 10 dk santrifüjleyin, süpernatantı aspire edin ve hücre peletini SCF ve EPO içeren 40 ml takviye edilmiş IMDM besiyerinde yeniden süspande edin.
      4. Hücre süspansiyonunu 8 T-175 flask'a dağıtın (flask başına 5 ml) ve her flask'a SCF ve EPO içeren 245 ml takviye edilmiş IMDM besiyeri ekleyin. Not: Artık her biri 0.1x106 hücre/ml konsantrasyonda 250 ml hücre içeren 8 flask'ımız var.
      5. 8. gündeki kalan hücreler (~40ml), %10 DMSO içeren takviye edilmiş IMDM besiyerinde 1-2x106 hücre/ml konsantrasyonda dondurulabilir ve sıvı azot içinde saklanabilir.
    • Gün 10:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için hematopoetik hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücre sayısını (yani ~5 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Hücre yoğunluğu ~1x106 hücre/ml olmalıdır.
  3. Adım 2: Gün 11-15
    Hücrelerin yaklaşık yarısı gelecekteki kullanım için (örneğin nükleer ekstraksiyon) toplanır. Geriye kalan eritroid hücreler, EPO içeren takviye edilmiş IMDM besiyerinde (Tablo 2 ve 3) MS-5 hücreleri üzerinde ko-kültüre edilir. Eritroid hücreler her 3-4 günde bir taze MS-5 tabakasına aktarılmalıdır.
    • Gün 11:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için eritroid hücreleri Trypan Blue ile sayın. Not: Hücre yoğunluğu ~1.5x106 hücre/ml olmalıdır.
      2. 1L 1xPBS, 400ml takviye edilmiş IMDM besiyerini ve EPO içeren 5L takviye edilmiş IMDM besiyerini (Tablo 2 ve 3) 37°C'de önceden ısıtın.
      3. 15x108 hücreye eşdeğer bir kültür hacmi (örneğin her biri 250 ml olan ~4 flask) ayırın ve e maddesine geçin.
      4. Kalan hücreler (örneğin 15x108) konik tüplerde toplanır, 450 g'de 10 dk santrifüjlenir, maksimum 108 hücre/ml olacak şekilde 0.1mM DTT içeren soğuk MS30 tamponunda (Tablo 5) yeniden süspande edilir ve gelecekteki kullanım için (örneğin nükleer ekstrakt) sıvı azot içinde şok dondurulduktan sonra -80°C'de saklanır.
      5. Konfluen olan 50 flask MS-5 hücresini her birini 20 ml 1xPBS ile yıkayın ve hemen her flask'a 80 ml EPO içeren taze takviye edilmiş IMDM besiyeri ekleyin. Not: Flask sayısının fazla olması nedeniyle, her seferinde 4 flask işlem yapıyoruz. Tam olarak; konfluen MS-5 hücrelerinin bulunduğu 4 flask'ı inkübatörden çıkarır, 1xPBS ile yıkar, 80 ml besiyeri ekler ve flask'ları inkübatöre geri koyarız. Tüm flask'lar hazırlandığında ve inkübatöre geri konulduğunda f adımına geçeriz. Büyük ölçekli bir prosedür için işlenecek flask sayısının çokluğu nedeniyle, bu adımların eş zamanlı çalışan iki kişi tarafından yürütülmesi faydalıdır.
      6. 15x108 eritroid hücre eşdeğerini 4 konik tüpte 450 g'de 10 dk santrifüjleyin ve süpernatantı atın.
      7. 4 hücre peletini her birini 100 ml takviye edilmiş IMDM besiyeri ile yıkayın.
      8. Her hücre peletini 250 ml EPO içeren takviye edilmiş IMDM besiyerinde yeniden süspande edin ve bu hücre süspansiyonundan 20 ml'yi, MS-5 hücreleri ve 80ml besiyeri içeren 50 flask'ın her birine dağıtın. Not: Bu adımda, 0.3x106 hücre/ml konsantrasyonda 100 ml eritroid hücre içeren, konfluen MS-5 hücreli 50 flask'ınız olmalıdır.
      9. Kalan 11 flask MS-5 hücresini, %0.05 EDTA'lı tripsin kullanarak T-175 flask'lara 1:5 oranında seyrelterek genişletin. Nihai hücre konsantrasyonu ~0.08x106 hücre/ml olmalıdır. Not: ~0.08x106 hücre/ml konsantrasyonda 55 flask MS-5 hücresi hazırlanmalıdır.
    • Gün 12:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için eritroid hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücre sayısını (yani ~4 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Hücre yoğunluğu ~0.6x106 hücre/ml olmalıdır.
    • Gün 14:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için eritroid hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücre sayısını (yani ~3 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Hücre yoğunluğu ~0.9x106 hücre/ml olmalıdır.
  4. Adım 3: Gün 15-18
    Bazı hücreler gelecekteki kullanım için (örneğin nükleer ekstraksiyon) toplanır. Geriye kalan eritroid hücreler, sitokin içermeyen takviye edilmiş IMDM besiyerinde MS-5 hücreleri üzerinde ko-kültüre edilir.
    • Gün 15:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için eritroid hücreleri Trypan Blue ile sayın. Not: Hücre yoğunluğu ~1x106 hücre/ml olmalıdır.
      2. 1L 1xPBS ve 5L takviye edilmiş IMDM besiyerini (Tablo 2) 37°C'de önceden ısıtın.
      3. 10x108 hücreye eşdeğer bir kültür hacmi (örneğin her biri 100 ml olan ~10 flask) ayırın ve e maddesine geçin.
      4. Kalan hücreler (örneğin 40x108) toplanır ve gelecekteki kullanım için 0.1mM DTT içeren soğuk MS30 tamponunda (Tablo 5) yeniden süspande edilir (bkz. Adım 2: Gün 11 d maddesi).
      5. Konfluen olan 50 flask MS-5 hücresini her birini 20 ml 1xPBS ile yıkayın ve hemen her flask'a 80 ml taze takviye edilmiş IMDM besiyeri ekleyin.
      6. 10x108 eritroid hücre eşdeğerini 4 konik tüpte 450 g'de 10 dk santrifüjleyin ve süpernatantı atın.
      7. 4 hücre peletini her birini 100 ml takviye edilmiş IMDM besiyeri ile yıkayın.
      8. Her hücre peletini 250 ml takviye edilmiş IMDM besiyerinde yeniden süspande edin ve bu hücre süspansiyonundan 20 ml'yi, MS-5 hücreleri ve 80ml besiyeri içeren 50 flask'ın her birine dağıtın. Not: Bu adımda, 0.2x106 hücre/ml konsantrasyonda 100 ml eritroid hücre içeren, konfluen MS-5 hücreli 50 flask'ınız olmalıdır.
      9. Kalan 5 flask MS-5 hücresini, %0.05 EDTA'lı tripsin kullanarak T-175 flask'lara 1:5 oranında seyrelterek genişletin. Nihai hücre konsantrasyonu ~0.08x106 hücre/ml olmalıdır. Not: ~0.08x106 hücre/ml konsantrasyonda 20 flask MS-5 hücresi hazırlanmalıdır. Kalan MS-5 hücrelerini dondurun ve sıvı azot içinde saklayın.
    • Gün 16:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için eritroid hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücre sayısını (yani ~4 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Hücre yoğunluğu ~0.6x106 hücre/ml olmalıdır.
  5. Adım 4: Gün 18-26
    Eritroid hücreler, nihai olarak 5-7x106 hücre/ml elde etmek için 3-4 kat konsantre edilir ve olgunlaşmaya izin vermek için MS-5 tabakasında tutulur. Kültüre edilmiş kırmızı kan hücrelerinin (cRBC'ler) daha iyi korunmasını sağlamak için takviye edilmiş IMDM besiyerine %10 FBS eklenir.
    • Gün 18:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için eritroid hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücre sayısını (yani ~2 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Hücre yoğunluğu ~1.7x106 hücre/ml olmalıdır.
      2. 300ml 1xPBS ve %10 FBS içeren 1.5L takviye edilmiş IMDM besiyerini (Tablo 2) 37°C'de önceden ısıtın.
      3. Konfluen olan 15 flask MS-5 hücresini her birini 20 ml 1xPBS ile yıkayın ve hemen her flask'a 80 ml taze takviye edilmiş IMDM besiyeri ekleyin.
      4. Eritroid hücreleri (yani 85x108 hücre eşdeğeri) 450 g'de 10 dk santrifüjleyin, birleştirin ve peleti 4 konik tüpe dağıtın.
      5. Her hücre peletini %10 FBS içeren 75 ml takviye edilmiş IMDM besiyerinde yeniden süspande edin ve bu hücre süspansiyonundan 20 ml'yi, MS-5 hücreleri ve 80ml besiyeri içeren 15 flask'ın her birine dağıtın. Not: Bu adımda, 6x106 hücre/ml konsantrasyonda 100 ml eritroid hücre içeren, konfluen MS-5 hücreli 15 flask'ınız olmalıdır.
      6. Kalan 5 flask MS-5 hücresini, %0.05 EDTA'lı tripsin kullanarak T-175 flask'lara 1:5 oranında seyrelterek genişletin. Nihai hücre konsantrasyonu ~0.08x106 hücre/ml olmalıdır. Not: ~0.08x106 hücre/ml konsantrasyonda 20 flask MS-5 hücresi hazırlanmalıdır. Kalan MS-5 hücrelerini dondurun ve sıvı azot içinde saklayın.
    • Gün 20:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için eritroid hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücre sayısını (yani ~1.5 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Hücre yoğunluğu ~1.5x106 hücre/ml seviyesinde tutulur.
    • Gün 22:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için eritroid hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücre sayısını (yani ~1.5 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Hücre yoğunluğu ~1.5x106 hücre/ml seviyesinde tutulur.
      2. Besiyerini değiştirin ve eritroid hücreleri Gün 18'de açıklandığı gibi yeni MS-5 hücre tabakalarına aktarın.
    • Gün 24:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için eritroid hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücre sayısını (yani ~1.5 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Hücre yoğunluğu ~1.5x106 hücre/ml seviyesinde tutulur.
    • Gün 26:
      1. Ölü hücreleri dışlamak için eritroid hücreleri Trypan Blue ile sayın ve testler için gerekli hücre sayısını (yani ~1.5 ml kültür) toplayın (bkz. paragraf 6). Not: Hücre yoğunluğu ~1.5x106 hücre/ml seviyesinde tutulur.
      2. Yapışmamış, enükleasyon geçirmiş ve tamamen hemoglobinize olmuş cRBC'leri toplayın. Not: Olgun cRBC'ler SAGM besiyerinde (MacoPharma) 4°C'de bir aya kadar saklanabilir.
  6. Testler ve temsili sonuçlar
    Hücre proliferasyonunun ve eritroid diferansiyasyonun uygunluğunu doğrulamak için belirtilen günlerde aşağıdaki testler uygulanır. Şekillerde sunulan temsili sonuçlar, lökaferezden izole edilen CD34+ hücreleri kullanılarak elde edilmiştir.
    1. Hücreler her iki günde bir sayılır. Hücre proliferasyonuna ait temsili sonuç için Şekil 2'ye bakınız.
    2. May-Grünwald Giemsa morfoloji boyaması, Giemsa boyası üreticisinin talimatları (Tablo 1) takip edilerek 0 ile 8. günler arasında 0.05 x106 hücre ve diğer günlerde 0.2x106 hücre kullanılarak her iki günde bir yapılır. Temsili sonuçlar için Şekil 3'e bakınız.
    3. Hematopoetik progenitörleri ölçmek için yarı katı assayler, Methocult yarı katı besiyeri üreticisinin talimatları (Tablo 1) takip edilerek 0. günden 12. güne kadar her iki günde bir assay başına 0.01x106 hücre kullanılarak çift örnekli olarak gerçekleştirilir. Temsili sonuçlar için Şekil 4'e bakınız.
    4. Aşağıdaki hücre markerlarının analizi, FACS ile her iki günde bir assay başına 0.2 x106 hücre kullanılarak yapılır: CD34, CD36, CD71, GPA, LDS. Temsili sonuçlar için Şekil 5'e bakınız.
    5. Hemoglobin, her iki günde bir benzidin boyaması ile ölçülür. Temsili sonuçlar için Şekil 5'e bakınız.
    6. Gen ekspresyonu, 1x106 hücreden RNA ekstraksiyonu yapıldıktan sonra RT-qPCR veya microarray ile incelenir. Temsili sonuçlar için Şekil 6B'ye bakınız.

Sonuçlar üzerine yorumlar:

Şekil 1, insan CD34+ hücrelerinin olgun, hemoglobin içeren kırmızı kan hücrelerine ex vivo farklılaşma protokolünü özetlemektedir. Eritroid farklılaşma sırasında hücreler yüksek düzeyde proliferatif özellik gösterirler; bu durum, lökaferezden izole edilen CD34+ hücreleri kullanılarak elde edilen ve Şekil 2'de gösterilen ~8.000 katlık amplifikasyon ile örneklendirilmiştir. Kemik iliğinden izole edilen CD34+ hücreleri ~6.000 katlık amplifikasyon ile biraz daha düşük proliferasyon gösterirken, kordon kanından izole edilen CD34+ hücreleri 50.000 kat amplifikasyona ulaşabilmektedir. Farklılaşmanın belirli aşamalarındaki hücreler, Şekil 3'te gösterilen ayırt edilebilir boyut ve morfolojiler sergilerler. 20. Günden itibaren başlayan ve farklılaşmanın sonunda gerçekleşen enükleasyon sürecine dikkat ediniz. 26. Günde tüm hücreler çekirdeklerini kaybetmiştir (Şekil 3).

Şekil 4'te gösterilen koloni oluşturma analizleri, diferansiyasyonun ilk günlerinde (0. Gün ile 8. Gün arası) erken ve geç hematopoetik progenitörlerin tespit edilmesi için kullanılır. Eritroid progenitörlere (CFU-E ve BFU-E) ek olarak, 0. Gün'deki erken CD34+ hücreler içerisinde granülosit-makrofaj progenitörlerin (CFU-GM) önemli ölçüde temsil edildiğini görmekteyiz. Diferansiyasyon ilerledikçe, CFU-GM belirgin şekilde azalır ve 6. Gün'de yerlerini tamamen eritroid progenitörler olan BFU-E ve CFU-E'ye bırakırlar. Ayrıca, 4. Gün ile 6. Gün arasında, erken eritroid progenitörler olan BFU-E'lerin yerini kademeli olarak daha diferansiye olan karşılıkları CFU-E'lerin aldığına dikkat etmek önemlidir. 10. Gün itibarıyla, eritroid hücreler koloni oluşturma kapasitelerini esasen kaybetmiş durumdadır.

Son olarak, eritropoez, Şekil 5'te gösterildiği gibi hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonu ile izlenir. Şunlara dikkat edin: 1) hematopoetik kök hücre/progenitör belirteci CD34'ün kademeli kaybı; 2) progenitör belirteci CD36'nın kademeli kazanımı ve kaybı; 3) eritroid progenitör ve retikülosit belirteci CD71'in kademeli kazanımı ve kaybı; ve 4) eritroid öncül hücre ve eritrosit belirteci GPA'nın artışı. Eritroid farklılaşmanın diğer belirteçleri arasında, 8. günde başlayan hemoglobin sentezi (benzidin boyaması ile ölçülmüştür-Şekil 5) ve 20. günde başlayan, DNA boyası LDS kaybı ile ölçülen hücre enükleasyonu (Şekil 5) yer alır. Son olarak, eritroid farklılaşma; transkripsiyon faktörü TAL1 (Şekil 6B) veya β-globin genleri (veriler gösterilmemiştir) gibi moleküler belirteçlerin RT-qPCR analizi ile ölçülebilir.

Genellikle, 1 ml kordon kanı / lökaferes / kemik iliği; sırasıyla 50.000 / 8.000 / 6.000 proliferasyon oranları ile teorik olarak 1,7x109 / 0,4x109 / 0,7x109 kırmızı kan hücresi üretebilen 0,35x105 / 0,5x105 / 1,1x105 CD34+ hücre sağlar. Diferansiyasyon prosedürünün sonunda 50x106 kırmızı kan hücresi elde etmek için yaklaşık 50 ml kültür ortamına ihtiyacınız olacaktır.

Bölüm II. Ex vivo eritroid diferansiyasyon sırasında lentiviral aracılı knockdown

Lentivirüs, insan primer hücrelerinde gen transferi için tercih edilen bir araçtır (örneğin bkz. Amsellem et al. 9). Lentivirüsler, hedefli shRNA iletimi aracılığıyla primer hücrelerde ilgili genlerin susturulması (knockdown) için sıklıkla kullanılır (örneğin bkz. Laurenti et al. 10). Bu protokolde, primer insan eritroid hücrelerindeki TAL1 transkripsiyon faktörünü hedefliyoruz. Herhangi bir bilinen genle eşleşmeyen, rastgele dizilimli (scrambled) bir shRNA negatif kontrol olarak kullanılır. Transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için GFP ekspresyonundan yararlanılır.

1. Lentiviral vektör partiküllerinin hazırlanması

Lentiviral partiküller elde etmek için, insan embriyonik böbrek 293T hücreleri üç plazmit ile kotransfekte edilir: biri env, vpr, vif, vpu ve nef dışındaki HIV-1 genlerini kodlayan ikinci nesil bir virüs paketleme sistemini içeren (yani psPAX2); biri veziküler stomatit G-psödotipleme virüsünün zarfını kodlayan (yani pMD2G) ve biri ilgi duyulan geni kodlayan bir lentiviral vektör (yani TAL1 shRNA'yı kodlayan pBLOCK-it6-DEST(shTal1), rastgele dizili shRNA'yı kodlayan pBLOCK-it6-DEST(shScr) veya GFP'yi kodlayan pWPIP) (Tablo 4). Lentiviral partiküller, transfekte edilmiş 293T hücrelerinin kültür süpernatantından toplanır.

Hücrelerin istenmeyen şekilde enfekte olmasını önlemek için, tüm lentiviral deneyleri (virüslerin hazırlanması ve enfeksiyon), diğer hücre kültürlerinden ayrı, özel bir çeker ocak altında gerçekleştiriyoruz. Ayrıca, lentivirüs kaynaklı atıklar ayrı olarak bertaraf edilir. Bu protokolde açıklanan ikinci nesil lentivirüsler replikasyon yeteneğinden yoksundur ve Biyogüvenlik Seviyesi 2 organizmalar olarak değerlendirilmelidir. Bazı kurumların lentivirüslerle ilgili özel güvenlik prosedürleri olabilir; bu nedenle yerleşik kurumsal yönergeleri takip etmenizi öneririz.

Burada, farklılaşmanın herhangi bir aşamasındaki 1 ila 2 milyon primer eritroid hücreyi enfekte etmek için yeterli lentiviral partikül sağlayacak bir protokol tanımlıyoruz. Hacimler, ölçeği büyütmek veya küçültmek için uygun şekilde ayarlanmalıdır. Reaktifler için Tablo 4 ve 5'e bakınız.

  1. Kalsiyum fosfat ile 293T hücrelerinin transfeksiyonu.
    1. Transfeksiyondan bir gün önce, 15 cm'lik bir hücre kültür kabına, %10 FBS ve Pen/Strep içeren 20 ml DMEM/Yüksek glukoz besiyerine 13.2 x 106 293T hücresi ekleyin. NB. Bu, hücrelerin transfeksiyon gününde %70 konfluens düzeyine ulaşmasını sağlamalıdır. En iyi sonuçlar düşük pasajlı (<20) 293T hücreleri kullanılarak elde edilir.
      Opsiyonel: 293T hücrelerinin adezyonunu artırmak için kaplar tip I kollajen veya Poli-L-lizin ile kaplanabilir.
    2. Transfeksiyondan iki saat önce, 293T hücrelerindeki besiyerini aspire edin ve nazikçe 37°C'ye ön ısıtılmış 20 ml taze besiyeri ekleyin. NB: Transfeksiyona genellikle gün sonunda başlarız.
    3. Aşağıdaki reaktifleri 5 ml'lik bir tüpte karıştırın:
      • İlgilendiğiniz gene ait 44.8 μg ekspresyon vektörü (örneğin shRNA veya GFP - bkz. Tablo 4)
      • 13.35 μg pMD2.G zarf vektörü.
      • 33.48 μg psPAX2 paketleme vektörü.
      • Hacmi 1.116 ml'ye tamamlamak için yeterli miktarda steril H2O ekleyin.
    4. Hacmi 1.116 ml'ye tamamlamak için yeterli miktarda steril H2O ekleyin.
    5. 109.8 μl 2.5M CaCl2 ekleyin ve karıştırmak için vorteksleyin.
    6. 50 ml'lik konik bir tüpe, 1.116 ml 2xHBS tamponu ekleyin (Tablo 5).
    7. Sürekli vorteks ajitasyonu altında, DNA karışımını 2xHBS tamponuna damla damla ekleyin.
    8. Çökeltenin oda sıcaklığında 20 dakika boyunca (30 dakikayı geçmeyecek şekilde) oluşmasını bekleyin.
    9. 2.3 ml'lik çözeltiyi 293T hücrelerini içeren kaba damla damla ekleyin, nazikçe dairesel hareketlerle karıştırın ve hücreleri 12-14 saat boyunca 37°C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
    10. Ertesi sabah erken saatlerde besiyerini aspire edin ve yerine 37°C'ye ön ısıtılmış 20 ml taze besiyeri ekleyin.
  2. Lentivirüs hasadı ve konsantrasyonu
    1. Transfeksiyondan kırk sekiz saat sonra, lentivirüs içeren 20 ml besiyerini hasat edin ve 50 ml'lik konik bir tüpe yerleştirin.
    2. 293T hücrelerine 37°C'ye ön ısıtılmış 20 ml besiyeri ekleyin ve inkübatöre geri koyun.
    3. Hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için viral süpernatantı 450 g'de 10 dakika santrifüj edin ve yeni bir 50 ml'lik tüpe aktarın. Alternatif olarak, süpernatant 0.45μm'lik bir filtreden geçirilebilir. Berraklaştırılmış süpernatantı 4°C'de saklayın.
    4. Yirmi dört saat sonra, kalan 20 ml besiyerini hasat edin. NB: Her iki hasatta virüs titrelerinin kabaca eşdeğer olduğunu, yani 1x 106 TU/ml olduğunu saptadık.
    5. Virüsleri konsantre etmek için, viral süpernatantlar Beckman OptiSeal tüplerine dağıtılır (tüp başına 32.4 ml süpernatant kullanın) ve salınan rotor kullanılarak 4°C'de 1.5 saat boyunca 100,000g'de santrifüj edilir. N.B. Virüs süpernatantını konsantre etmek için alternatif yöntemler arasında 2 saat boyunca 47,000 g'de veya 8 saat boyunca 3,000 g'de santrifüjleme yer alır. Konsantrasyon öncesinde virüsü dondurmayın. Dondurma işlemi proteinlerin çökmesine neden olarak virüsün yeniden süspansiyonunu zorlaştıracaktır.
    6. Ultrasantrifüjden hemen sonra, süpernatantı 10 ml'lik plastik bir pipet kullanarak yavaşça aspire edin ve atın. NB: Tüpten kolayca ayrılabilecek olan pelete zarar vermemeye dikkat edin. Süpernatantın ilk 5 ml'sini attıktan sonra, mümkün olduğunca fazla süpernatantı uzaklaştırmaya yardımcı olmak için genellikle ultrasantrifüj tüpünün üst kısmını keseriz; yani tüpün dibinde ~100-200 μl besiyeri bırakırız.
    7. 100 μl 1xPBS ekleyin, peletin oda sıcaklığında 30 dakika çözülmesini bekleyin ve 15-20 kez pipetleyerek yeniden süspanse edin. NB: Genellikle ~200-300 μl konsantre virüs elde ederiz.
    8. Konsantre lentivirüs preparatı, Invitrogen protokolü (Block-it lentiviral RNAi Expression System) kullanılarak NIH3T3 hücreleri üzerinde titre edilir. NB: Genellikle 2 ila 10x108 transduksiyon birimi (TU)/ml viral titre elde ederiz.
    9. Virüs artık enfeksiyon için kullanılabilir (bkz. paragraf 2) veya alikotlara ayrılarak -80°C'de 6 aya kadar saklanabilir. NB: Virüs süspansiyonlarını birden fazla dondurma-çözme döngüsüne tabi tutmayın. Virüsler 37°C'de 4-5 saat, oda sıcaklığında 2-3 gün veya 4°C'de bir hafta boyunca stabildir.

2. Gen aktarımı için primer eritroid hücrelerin lentiviral enfeksiyonu

  1. Enfeksiyon
    Yüksek bir 50-100 MOI (enfeksiyon çokluğu) kullanıldığı sürece, çekirdekli eritroid hücreler farklılaşmanın herhangi bir aşamasında verimli bir şekilde enfekte edilebilir. Burada, TAL1 veya scramble shRNA eksprese eden lentivirüslerin, farklılaşmanın 8. ve 9. günlerinde 50 TU/hücre MOI kullanılarak eritroid hücreleri enfekte ettiği tipik bir deneyi tanımlıyoruz. RT-qPCR ile TAL1 KD düzeyi doğrulamak için her 24 saatte bir RNA ekstre edilir. Enfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için paralel olarak FACS ile GFP ekspresyonu ölçülür (temsili sonuçlar için Şekil 6'ya bakınız).
    • Gün 0:
      1. Her biri 1x106 eritroid hücre içeren üç adet 15 ml'lik konik tüp hazırlayın (yani; bir tüp TAL1 knockdown, bir tüp scrambled negatif kontrol, bir tüp GFP ekspresyon kontrolü için).
      2. Hücreleri SCF ve EPO içeren desteklenmiş IMDM besiyeri (Bölüm I'e bakınız) ile 5 ml yıkayın, 200 g'de 5 dk santrifüjleyin ve süpernatantın mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın.
      3. Konsantre virüs solüsyonuna 40 μg/ml nihai konsantrasyonda polybrene (Tablo 4) ekleyin.
      4. Her bir eritroid hücre tüpüne polybrene içeren 100 μl konsantre virüs (yani 5x107 TU) ekleyin.
      5. 37°C'deki inkübatörde 1 saat inkübe edin ve her 10 dakikada bir parmakla vurarak karıştırın. Not: Lentivirüsün hücrelere maksimum adsorpsiyonuna izin vermek için enfeksiyon minimum miktarda besiyeri ile gerçekleştirilmelidir. Ayrıca, her 10 dakikada bir karıştırmak, virüsün hücreler arasında eşit dağılımını sağlar.
      6. Her tüpe SCF ve EPO içeren (Tablo 2 ve 3) 900 μl desteklenmiş IMDM besiyeri ekleyin.
      7. Her örneği 6 kuyucuklu bir plakaya aktarın ve 24 saat boyunca 37°C'deki inkübatöre yerleştirin.
    • Gün 1: Hücreleri ayrı 15 ml'lik tüplerde toplayın, 200 g'de 5 dk santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve enfeksiyonu tekrarlayın (yukarıdaki b'den g'ye kadar olan adımlar).
    • Gün 2: Hücreleri yıkayın ve SCF ve EPO içeren desteklenmiş IMDM içinde 0,2x106 hücre/ml konsantrasyonda süspansiyona getirin ve Bölüm I'deki gibi ilerleyin.
  2. Temsili sonuçlar
    Şekil 6A, primer eritroid hücrelerin lentivirüs enfeksiyonu ve ardından RNA ekstraksiyonu için izlenen protokolü göstermektedir. Bir deneyde, eritroid hücreleri transkripsiyon faktörü TAL1'e karşı hedeflenmiş bir shRNA veya bir scrambled kontrol üreten lentivirüs ile enfekte ettik 11. Şekil 6B, primer eritroid hücrelerde TAL1 transkriptlerinin %75'ini nakavt etmede (knockdown) başarılı olduğumuzu göstermektedir. Lütfen ayrıca, scrambled kontrolde 9. günden 12. güne kadar TAL1 transkript düzeyindeki artışın, bu transkripsiyon faktörünün eritroid farklılaşması sırasındaki önemini vurguladığını dikkate alın. Başka bir deneyde, eritroid hücreleri GFP proteini eksprese eden lentivirüs ile enfekte ettik. Şekil 6C, enfeksiyondan üç gün sonra, mikroskop altında floresan ve FACS ile ölçüldüğü üzere, eritroid hücrelerin çoğunun (%87) GFP eksprese ettiğini göstermektedir. Bu, primer eritroid hücrelerde yüksek bir enfeksiyon verimliliğine işaret eder. Daha önce CD34+ hücreleri Gün 0'da benzer bir enfeksiyon verimliliği ile enfekte ettik (veriler gösterilmemiştir). Primer hücrelerin verimli transduksiyonu için en önemli parametre, yüksek bir MOI (yani konsantre lentivirüsler) kullanmaktır. Düşük bir MOI kullanıldığında (yani konsantre edilmemiş virüs), transduksiyon verimliliği azalacaktır.

3. Temsili Sonuçlar

Pozitif izolasyon CD34+ HSC'ler diyagramı; immunomanyetik ayırma, serumsuz eritroid farklılaşma.
Şekil 1. İnsan primer hematopoetik kök/progenitör hücrelerin izolasyonu ve ex vivo eritroid farklılaşması için protokol taslağı. (Adım1) CD34+ hücreler (saflık %95 ± 3), kordon kanı, kemik iliği veya G-CSF ile mobilize edilmiş insan periferik kanından (lökaferesis) pozitif immunomanyetik seleksiyon kullanılarak izole edilir. (Adım2) CD34+ hücreler, belirtilen dört aşamalı protokole göre sıvı kültürde büyütülür.

Hücre amplifikasyon grafiği; logaritmik ölçek; kültür günleri ile hücre büyüme trend analizi.
Şekil 2. ex vivo eritroid diferansiyasyon protokolü sırasında hücre amplifikasyonu. Sonuçlar logaritmik ölçektedir. Lökaferezden izole edilen CD34+ hücrelerle elde edilen temsili sonuçlar.

Eritropoez aşamaları şeması, 26 gün boyunca RBC gelişimini izleyen mikroskop görüntüleri.
Şekil 3. Ex vivo eritroid farklılaşma sırasında hücre morfolojik analizi. Hücreler, farklılaşma sırasında belirtilen zaman noktalarında May-Grünwald-Giemsa reaktifi ile boyanmıştır (büyütme x 40). HSC: hematopoetik kök/progenitör hücreler; BFU-E: burst forming units –erythroid; CFU-E: colony forming units –erythroid; Pro EB: pro-eritroblastlar; Baso EB: bazofilik eritroblastlar; Poly EB: polikromatofilik eritroblastlar; Ortho EB: ortokromatik eritroblastlar; RET: retikülositler; RBC: kırmızı kan hücreleri.

Yarı katı assay şeması; progenitor büyümesi CFU-GM, BFU-E, CFU-E; hücre kültürü günleri; görüntü karşılaştırması.
Şekil 4. Hematopoetik progenitorleri tespit etmek ve niceliklerini belirlemek için koloni oluşturan hücre (CFC) assayleri. Belirtilen zaman noktalarında, eritroid progenitorlerin (BFU-E ve CFU-E) ve granülosit-makrofaj progenitorlerin (CFU-GM) optimal büyümesini desteklemek için rekombinant insan sitokinleri (rh SCF, rh GM-CSF, rh G-CSF, rh Il-3, rh EPO) içeren yarı katı metilselüloz ortamına 104 hücre ekilmiştir. BFU: burst forming units (patlama oluşturan birimler); CFU: colony forming units (koloni oluşturan birimler). BFU-E ve CFU-E'nin tipik görüntüleri de gösterilmiştir. BFU-E ve CFU-E'nin hemoglobinizasyonuna bağlı olarak ortaya çıkan kırmızı-kahverengi renge dikkat ediniz.

Hücre markerları CD34, CD36, CD71, GPA, Benzidin ve LDS'nin zaman içindeki değişimini gösteren hematopoetik diferansiyasyon grafikleri.
Şekil 5. ex vivo eritroid diferansiyasyon sırasında hematopoetik/eritroid markerların kinetiği. Belirtilen zaman noktalarında, 2x105 hücre toplandı ve belirtilen markerların ekspresyonu FACS (CD34, CD36, CD71, GPA ve LDS) veya mikroskopi (Benzidin) ile analiz edildi. Çubuklar pozitif hücrelerin yüzdelerini temsil etmektedir. CD34: insan hematopoetik kök/progenitör hücrelerinde bulunan transmembran glikoprotein; CD36: progenitör hücrelerde bulunan trombospondin reseptörü; CD71: eritroid progenitörlerde ve retikülositlerde bulunan transferrin reseptörü; GPA: eritroid öncüllerde ve eritrositlerde bulunan glikoforin A; Benzidin: hemoglobin boyası; LDS: lazer boya stiril, DNA boyası.

Lentivirüs shRNA enfeksiyon zaman çizelgesi, TAL1 mRNA ekspresyon sütun grafiği, GFP mikroskopisi, akış sitometrisi.
Şekil 6. İnsan primer proeritroblastlarında lentiviral aracılı gen transferi. (A) Lentiviral gen iletim sistemi kullanılarak primer proeritroblastlarda TAL1 nakavt (KD) indüksiyonu için zaman çizelgesi. (B) TAL1 nakavt, lentivirüs ile iletilen anti-Tal1 shRNA (TAL1 KD) veya karışık (scrambled) kontrol shRNA (Scr) aracılığıyla gerçekleştirilmiştir. TAL1 mRNA transkript düzeyinin kinetiği RT-qPCR ile ölçülmüştür. TAL1 transkripti, 18S RNA'ya göre ifade edilmiştir. (C) Lentivirüs ile iletilen GFP, mikroskopi (sol panel) veya FACS (sağ panel) ile test edilmiştir. Hücrelerin %87'si GFP pozitiftir.

4. Materyaller

ReaktifKaynakKatalog numarası
RPMI 1640 SigmaR8758
Kollagenaz BRoche Applied Science11088807001
DNaz ISigmaD5025-15KU
Ayırma Öncesi Filtreler (30μm naylon ağ)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
EasySep 10x Eritrosit Lizis TamponuStemCell Technologies20120
CD34 MicroBead KitiMiltenyi Biotec Inc130-046-703
LS Mini-Macs kolonlarıMiltenyi Biotec Inc130-042-401
autoMACS Çalıştırma Tamponu-MACS Ayırma TamponuMiltenyi Biotec Inc130-091-221
MiniMACS AyırıcıMiltenyi Biotec Inc130-042-102
Fare kemik iliği stromal hücreleri MS-5 (düzenli olarak mikoplazma kontaminasyonu için test edilmelidir)DSMZACC 441
Tripan Mavisi Çözeltisi (0.4%)SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
Tripsin 0.05%/EDTAThermoScientific J101521
May Grunwald Giemsa Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
İnsan Hücreleri için Methocult Koloni Oluşturan Hücre (CFC) Analizleri StemCell Technologies 04044

Tablo 1.

BileşenStok çözeltiHacim 600 ml
IMDMSigma I3390443.4 ml
Pen/Strept %1 (hac/hac)Gibco 103786ml
L-glutamin 4x10-3M200mM (Gibco 25030)12 ml
Inositol 40μg/ml4mg/ml (Sigma I5125)
hazırlama: 28 mg tozu 7 ml IMDM içinde çözün ve filtre ile sterilize edin; 4°C'de 1 hafta boyunca stabildir.		6ml
Folik asit 10μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
hazırlama: 7 mg tozu 7 ml ön ısıtılmış IMDM içinde çözün ve filtre ile sterilize edin; 4°C'de 1 hafta boyunca stabildir. Kullanmadan önce ön ısıtma yapın.		6ml
Monotiyogliserol 1.6x10-4M0.16M (Sigma M6145)
hazırlama: 10 μl 11.56M stok çözeltiyi 712 μl IMDM içinde çözün ve filtre ile sterilize edin; 4°C'de 1 hafta boyunca stabildir.		0.6ml
Ferroz nitrat 90 ng/ml18μg/ml (Sigma 8508)
hazırlama: 1.8 mg'ı 1ml distile suda çözün. 0.1 ml alın, 9.9 ml IMDM ekleyin ve filtre ile sterilize edin; 4°C'de 1 hafta boyunca stabildir.		3ml
Ferroz sülfat 900 ng/ml180 μg/ml (Sigma F8633)
hazırlama: 18 mg'ı 1ml distile suda çözün. 0.1 ml alın, 9.9 ml IMDM ekleyin ve filtre ile sterilize edin; 4°C'de 1 hafta boyunca stabildir.		3ml
Sığır serum albümini-İnsülin-Transferrin (BIT)
%20 (hac/hac)		StemCell Technologies 9500120 ml

Tablo 2.

BileşenStok çözelti100 ml takviyeli IMDM'ye eklenecek hacim (Tablo 2)
Hidrokortizon (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
hazırlanışı: 5mg tozu 1,03ml IMDM içinde çözün. 0,1 ml alın, 9,9 ml IMDM ekleyin ve filtre sterilizasyonu yapın. 4°C'de 1 hafta boyunca stabildir.		1ml
Kök Hücre Faktörü (SCF) 100ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
hazırlanışı: 50 μg tozu 500 μl PBS+0,1% BSA içinde çözün ve filtre sterilizasyonu yapın. 100 μl'lik alikotlar hazırlayın ve -20°C'de saklayın.		100 μl
Eritropoietin (EPO) 3 IU/ml12.000UI/ml'ye eşdeğer 100 μg/ml (Feldan FB03-10-290)
hazırlanışı: 50 μg tozu 500 ml PBS+0,1% BSA içinde çözün ve filtre sterilizasyonu yapın. 25 ml'lik alikotlar hazırlayın ve -20°C'de saklayın.		25 μl
İnterlökin 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
hazırlanışı: 10 μg tozu 100 μl PBS+0,1% BSA içinde çözün ve filtre sterilizasyonu yapın. 5 ml'lik alikotlar hazırlayın ve -20°C'de saklayın.		5 μl

Tablo 3.

ReaktifKaynakReferans
293T hücreleri
(düzenli olarak mikoplazma kontaminasyonu için test edilmelidir) 		ATCCCRL-11268
DMEM/Yüksek GlikozThermoScientificSH30243.01
Heksadimetrin bromür (Polybrene)SigmaH9268-5G
OptiSeal ultrasantrifüj tüpleriBeckman Coulter361625
psPAX2 plazmidiAddgene (D. Trono laboratuvarı)12260
pMD2.G plazmidiAddgene (D. Trono laboratuvarı)12259
pBLOCK-it6-DEST (shTal1) plazmidiInvitrogen'den alınan pBLOCK-it6-DEST plazmidine klonlanmış Tal1 shRNA dizisiPalii et al. EMBO J.
pBLOCK-it6-DEST (shScr) plazmidiInvitrogen'den alınan pBLOCK-it6-DEST plazmidine klonlanmış karmaşık (scrambled) shRNA dizisiPalii et al. EMBO J.
pWPI plazmidiAddgene (D. Trono laboratuvarı)12254

Tablo 4.

TamponHazırlanışıFinal konsantrasyonu
2xHBS
  • 1.6 g NaCl
  • 1.3 g HEPES
  • 0.04 g Na2HPO4(7H2O)
  • Milli-Q su ekleyin.
  • NaOH çözeltisi ekleyerek pH değerini tam olarak 7.11-7.13'e ayarlayın ve hacmi Milli-Q su ile 100 ml'ye tamamlayın.
  • pH değerini 7.11-7.13 olarak kesinleştirin.
  • Filtre sterilizasyonu yapın, 10 ml'lik alikotlar hazırlayın ve -200C'de saklayın.
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1.5 mM
CaCl2
  • 2.77 g susuz CaCl2
  • 10 ml Milli-Q su içerisinde çözün.
  • Filtre sterilizasyonu yapın, 1 ml'lik alikotlar hazırlayın ve -20°C'de saklayın.
  • 2.5M
MS30
  • 25ml [2M] Tris pH8.0
  • 5ml [0.5M] EDTA
  • 300ml Gliserol
  • 50mM
  • 2.5mM
  • %30 (v/v)

Tablo 5.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yöntemler bir dizi değişken derecelerde başarı ile kültür eritroid hücrelerin ayırt etmek için daha önce kullanılmıştır. Örneğin, MS-5 ko-kültür olmadan bazı protokolleri eritroid hücrelerin genişlemesi sağlar, ancak 12-17 tam olgun enükleasyon kırmızı kan hücrelerinin üretiminde etkili değildir . Diğer yöntemlerle verimli enükleasyon izin verirken, proliferasyon 18,19 pahasına. Başlangıçta Douay laboratuvar 6 tarafından geliştirilen, burada kullanılan yöntem, (genomik ve proteomik çalış...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Biz kan örnekleri (Ottowa Hastanesi Araştırma Etik Kurulu altında elde edilen sağlamak için ex vivo eritroid farklılaşma, D. Allan ve H. Atkins (Ohri, Kanada) tavsiye L. Douay ve MC Giarratana (Université Paris VI, Fransa) teşekkür # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) eleştirel bir yazının okunması için lentiviral vektörler ve FJ Dilworth (Ohri, Kanada) sağlamak için. Bu proje MBCGP bir CIHR hibe (MOP-82.813) tarafından finanse edildi Ontario Araştırma Fonu Hesaplamalı Regulomics Eğitim Doktora Sonrası Araştırma Bursu bir alıcı. MB, Kanada Araştırma Başkanı Gen İfadesi Yönetmeliği tutar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Kaynaklar

  1. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  2. Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
  3. Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
  4. Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).
  5. Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).
  6. Giarratana, M. C. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  7. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).
  8. Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
  9. Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther. 6, 673-677 (2002).
  10. Laurenti, E. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).
  11. Palii, C. G. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J. 30, 494-509 (2011).
  12. Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood. 73, 100-103 (1989).
  13. Wada, H. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood. 75, 505-511 (1990).
  14. Sui, X. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med. 183, 837-845 (1996).
  15. Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood. 92, 3658-3668 (1998).
  16. Lindern, M. von The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood. 94, 550-559 (1999).
  17. Freyssinier, J. M. amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).
  18. Malik, P. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood. 91, 2664-2671 (1998).
  19. Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood. 103, 4310-4316 (2004).
  20. Mazurier, F. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther. 5, 556-562 (1998).
  21. Salmon, P. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood. 96, 3392-3398 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

CD34 Pozitif Hücre İzolasyonuStromal Hücre Ko-kültürüLentivirüs Enfeksiyon ProtokolüGFP Ekspresyon AnaliziRT-qPCR Nakavt DoğrulamasıTAL1 Transkripsiyon FaktörüEritroid Diferansiyasyon Protokolü
Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.