Biyogüvenlik Geliştirilmiş Polimer complexed Ecotropic lentivirüs İnsan Hücreleri, İletimi

Özet

Lentiviruses genin fonksiyonu keşfetmek için çok değerli bir araştırma aracı; Ancak, araştırmacılar bilinen pantropic lentivirüs kodlama ya da şüphesi onkogenler üretimi önlemek için isteyebilirsiniz. Alternatif olarak, biz ecotropic reseptör mSlc7a1 ifade etmek için modifiye insan hücreleri üzerinde ecotropic lentivirüs kullanmak için daha güvenli bir protokol mevcut.

Özet

Kök ve tümör hücre biyolojisi çalışmaları genellikle laboratuvar personeli için önemli güvenlik sorunları yükselterek, bilinen ya da şüphelenilen onkogenler insan hücrelerinde viral transdüksiyon gerektirir. Yaygın olarak kullanılan VSV-G pseudotype Pantropic lentiviruses, gen fonksiyonu olmayan bölünen hücreleri de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri, transduce çünkü çalışmak için değerli bir araç. Ancak, araştırmacılar, üretim ve yüksek biyogüvenlik düzey sürüş gereksinimleri ve güvenlik sorunları nedeniyle onkogenler kodlama pantropic virüs santrifüj önlemek için isteyebilirsiniz. C-Myc ve SV40 büyük T antijeni dahil olmak üzere birçok güçlü onkogenler, bağlı pluripotent kök hücreleri (iPSC) üretimini artırmak için bilinmektedir. Tüm diğer iPSC indükleyici genetik değişiklikler (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28 ve p53 kaybı) fonksiyonu da nispeten yüksek güvenlik endişesi de bunları yaparken, kanser bağlantılar var.

Kanser ile ilgili bu virüsler hücresel yeniden programlama ve pluripotency eğitim yararlı olsa da, güvenli bir şekilde kullanılması gerekir. Bu biyogüvenlik konuları ele almak için, düşük maliyet ve uygun taşıma hakkında ek vurgu ecotropic lentivirüs insan hücrelerinin transdüksiyon için bir yöntem göstermektedir. Biz% 90 daha fazla uyum sağlamak yeterince yüksek titreye sahip ecotropic lentivirüs reseptör ifade, bu yaklaşımın etkinliği doğrulayarak, virüse maruz kalan insan hücreleri.

Lentivirüs genellikle Ultrasantrifügasyon yoğunlaşmıştır; Ancak, bu işlem birkaç saat sürer ve infeksiyöz aerosollerin insan biyomedikal araştırmacıların üretebilir. Daha güvenli bir alternatif, viral parçacıkların, kondroitin sülfat ve polybrene (CS / PB) kompleks hücrelerin üzerine tortulaşmış olabilir gibi. Bu teknik, fonksiyonel viral titresi stably önemsiz eklenen zaman ve maliyet, fare retrovirüs reseptör ifade hücreleri 3-kat artar. Insan dermal fibroblastlar (HDFS) İletimi maksimum bu polimer konsantrasyonu ilgi hedef hücre tipi için titre edilmelidir, kanser hücre hatları için daha önce rapor edilen en iyi değerden yaklaşık 4 kat daha düşük CS / PB konsantrasyonları kullanılarak geliştirilmiştir. Bu nedenle yeni bir hücre tipi polimer toksisite için tahlil methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) kullanımını tanımlamak. Biz, minimal akut toksisite gösteren viral transdüksiyon sonra polimer kompleksleşme veya polybrene (PB, 6 mg / ml) standart dozda ya HDFS eşdeğer canlılığı gözlemliyoruz.

Bu protokol, biyogüvenlik riskleri azaltarak ve transdüksiyon hızını artırarak, insan hücrelerinde onkogenlerin aşırı ekspresyonu için ecotropic lentivirüs kullanımı açıklanmaktadır. Ayrıca viral parçacıkların aerosol oluşturan santrifüj kaçınarak transdüksiyon geliştirmek için polimer kompleksleşme kullanımını göstermek.

Protokol

1. Lentivirüs üretimi, hasadı ve dondurulması

1. Bu protokole başlamadan önce kurumunuzun güvenlik sorumlusuna danışın ve önerilen güvenlik yönergelerini izleyin.
2. 1. Gün. Virüs üretmek için sağlıklı, hızla büyüyen 293T hücreleri ile başlayın. Hücreleri 10 cm'lik plaka başına 5 x 10⁶ hücre olacak şekilde ekleyin. Virüs üretimi için antibiyotiksiz 293T medyumu (%10 FBS ve 4 mM L-glutamin içeren yüksek glukozlu DMEM) kullanın.
3. 2. Gün. Öğleden sonra geç saatlerde, 293T hücrelerini şu şekilde transfekte edin (verilen sayılar bir adet 10 cm'lik plaka içindir). Tüm reaktiflerin oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Bir mikrosantrifüj tüpüne 375 μl OptiMEM pipetleyin, ardından 25 μl Fugene HD ekleyin. Seyreltilmemiş Fugene'in tüp yüzeyine temas etmesine izin vermeyin.
4. Bir mikrosantrifüj tüpünde şunları karıştırın:
   • 5 μg transfer plazmidi (Slc7a1, hedef vektör veya floresan kontrol vektörü)
   • 3.75 μg paketleme plazmidi (pCMV-dR8.91 veya psPax2)
   • 1.25 μg zarf plazmidi (pantropik için pMD2.G, ekotropik için pHCMV-EcoEnv)
   • 100 μl'ye tamamlanacak kadar serumsuz OptiMEM
5. İki tüpü birleştirin ve karışımı oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edin.
6. 293T hücrelerinin medyumunu 10 ml taze antibiyotiksiz 293T medyumu ile değiştirin. Fugene/plazmid karışımını plakaya damla damla ekleyin ve 37°C, %5 CO₂ ortamında gece boyunca inkübe edin.
7. 3. Gün. 293T hücrelerinin medyumunu 10 ml taze antibiyotiksiz 293T medyumu ile değiştirin. Nazik olun; çünkü 293T hücreleri sadece gevşek bir şekilde tutunur ve medyumun monotabaka üzerine çok sert pipetlenmesiyle yerinden kopabilirler. Virüs üretimi için nemlendirilmiş bir inkübatörde iki gün boyunca inkübe edin.
8. 5. Gün. Virüsü hasat edin ve 0.45 mm düşük protein bağlayan filtre ile filtreleyin. Hemen kullanın veya tek kullanımlık alikotlara bölerek -80°C'de dondurun. Dondurulmuş pantropik ve ekotropik virüsler, sırasıyla altı ay ve bir ay saklandıktan sonra yeniden titre edilmelidir.
9. Transdüksiyona nispeten yatkın olan hücreleri kullanarak virüsü şu şekilde titre edin. 6 μg/ml PB içeren taze medyumda seri dilüsyonlar (örneğin 1:10, 1:100, 1:1000) kullanarak hücreleri floresan kontrol virüsü ile gece boyunca transdükte edin. Ertesi gün taze medyumla değiştirin. Hücrelerin floresan proteini eksprese etmeye başlaması için transdüksiyondan sonra iki gün bekleyin, ardından transdükte edilen hücrelerin oranını FACS ile belirleyin. Çoklu transdüksiyon olaylarını en aza indirmek için < %15 transdüksiyon sağlayan dilüsyonlara dayanarak, ml başına transforming unit (TU) cinsinden titreyi hesaplayın.
   

2. İnsan hedef hücrelerinin fare retrovirüs reseptörü Slc7a1 ile transduksiyonu

1. Çoğu hücrenin transdukt edildiğinden emin olmak için enfeksiyon çokluğu (MOI) = 2 seçin. HDF'ler gibi transduksiyona dirençli hedef hücreler için daha yüksek bir MOI gerekecektir; hücrelerin çoğunluğunun transduksiyonunu sağlamak için viral süpernatantı yalnızca 1:2 oranında seyrelttik.
2. Hedef hücreleri, virüs ile hedef hücre arasındaki elektrostatik etkileşimi artırarak transduksiyonu yükselten, 6 μg/ml PB içeren taze kültür ortamında seyreltilmiş viral süpernatant ile gece boyunca transdukt edin.¹ Difüzyon, transduksiyon verimliliğinde sınırlayıcı bir faktör olduğundan, ideal olarak 35 mm'lik bir plak için 1 ml gibi minimum miktarda virüs kullanılmalıdır.
3. Slc7a1 reseptörünün yeterli düzeyde ekspresyonunu sağlamak için, ekotropik virüs ile transdukt etmeden önce virüsü uzaklaştırıp hücreleri en az 48 saat boyunca kültüre edin.
4. (Opsiyonel) İstenirse, Slc7a1 eksprese eden stabil olarak transdukt edilmiş hücreleri seçmek için blastisidin kullanılabilir. Transdukt edilmemiş tüm hedef hücreleri 7 gün içinde öldüren, genellikle 2 – 10 μg/ml arasında olan en düşük etkili konsantrasyonu belirlemek için önceden bir blastisidin öldürme eğrisi oluşturulmalıdır. Slc7a1 virüsü uzaklaştırıldıktan yaklaşık 2 gün sonra, transdukt edilen hücreleri blastisidin içeren ortama aktarın. Hücreleri blastisidin içeren ortamda 7 gün boyunca kültüre edin; bu noktada geri kalan tüm hücreler retrovirüs reseptörünü stabil olarak eksprese edecek ve böylece hem ekotropik virüs ile transdukt edilebilecekler hem de gelecekte kullanım için stabil Slc7a1 eksprese eden bir hat olarak saklanabileceklerdir.

3. Toksisiteyi belirlemek için polimer kompleks titrasyonu

1. 1. Gün. Hücreleri, her bir deneysel grup için en az üç tekerrürlü kuyucuk kalacak şekilde 96 kuyucuklu bir plakaya, kuyucuk başına 5000 hücre olacak şekilde ekle. Sağlıklı hücreler için temel bir değer sağlamak amacıyla tam besiyerinde transdüksiyon yapılmamış hücreleri ve kontrol olarak büyüme durmasını indüklemek için serumsuz besiyerindeki hücrelerden oluşan örnekleri dahil et. Paralel olarak, her bir deneysel koşulda transdüksiyon verimliliğinin mikroskobik veya FACS tabanlı analizi için hücreleri uygun bir formatta (örneğin 24 kuyucuklu bir plaka) ekle.
2. 2. Gün. Hem MTT hem de FACS analizleri için hazırlanan plakalardaki hücreleri, hedef hücrelerin ~%40'ını transdükse etmek için 0.5 MOI değerinde GFP kodlayan virüs ile transdükse et. Optimal miktarları belirlemek için farklı CS/PB konsantrasyonlarını (örneğin her bir bileşenin 50, 100, 200, 400, 600 ve 800 mg/ml konsantrasyonları) ve ayrıca 6 μg/ml PB'yi test et. Polimer komplekslerini, aşağıda Bölüm 4'te açıklandığı şekilde oluştur.
3. 3. Gün. Virüs içeren besiyerini uzaklaştır ve taze besiyeri ile değiştir. Plakaları nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştir.
4. 5. Gün. Her bir polimer konsantrasyonu ile transdüksiyon verimliliğini belirlemek için FACS plakasını analiz et.
5. 6. Gün. MTT plakasının tüm kuyucuklarındaki besiyerini uzaklaştır ve 100 μl MTT çözeltisi (tam besiyerinde 1 mg/ml MTT) ile değiştir. MTT'nin metabolik olarak aktif hücrelerin mitokondrilerinde indirgenmesini sağlamak için nemlendirilmiş inkübatörde üç saat boyunca kültüre et.
6. MTT çözeltisini uzaklaştır ve 200 ml MTT solventi (izopropanolda 0.1 N HCl, %0.1 Igepal CA-630) ile değiştir.
7. Oda sıcaklığında iki saat boyunca veya mor renkli MTT formazan çökeleğinin tamamı çözünene kadar inkübe et. Absorbansı, 690 nm'deki arka plan okumasını çıkararak bir mikroplaka okuyucuda 570 nm'de oku.
8. FACS ile belirlendiği üzere transdüksiyonun maksimum artışını sağlayan ve MTT ile belirlendiği üzere metabolik aktivite üzerinde minimum etkiye sahip olan optimal polimer konsantrasyonunu seç. HDF'ler için, aşağıda Temsili Sonuçlar'da gösterilen verilere dayanarak 100 μg/ml CS/PB'yi seçtik.

4. Polimer komplekslemesi ile ekotropik transdüksiyon

1. PB ve kondroitin sülfatın suda 20 mg/ml'lik steril filtre edilmiş stok çözeltilerini hazırlayın. Alikotlara ayırın ve -20°C'de saklayın.
2. Viral süpernatantı bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve taze kültür ortamı ile istenen son konsantrasyona (örneğin 2 MOI) seyreltin. PB ve kondroitin sülfatın (konsantrasyonları yukarıdaki 3. adımda belirlenmiş) eşit hacimlerini sırasıyla ekleyin ve her eklemeden sonra tüpü hafifçe vurarak karıştırın. Çökeltiler oluştukça viral karışım anında bulanıklaşacaktır. Kompleks oluşumuna izin vermek için viral karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
3. Reseptör eksprese eden hedef hücrelerdeki ortamı uzaklaştırın, yerine viral karışımı ekleyin ve 37°C, %5 CO2'de gece boyunca inkübe edin. Viral karışımı uzaklaştırdıktan sonra, viral komplekslerin temizlenmesine yardımcı olmak için hücre yüzeyini iki kez PBS ile yıkayın. Tamamen uzaklaştırmak gerekli değildir; kalıntı polimer komplekslerinin hücre sağlığı üzerinde herhangi bir olumsuz etkisine rastlamadık.

5. Ekotropik transdüksiyon spesifitesinin doğrulanması

1. Ekotropik virüs ilk kez üretildiğinde, güvenlik açısından virüsün modifiye edilmemiş insan hücrelerini transduse edemediğinin doğrulanması yerinde olacaktır. İnsan hücrelerini, nispeten yüksek konsantrasyonda ekotropik lentivirüs ile (viral süpernatantın taze ortamda sadece 1 ila 2 kat dilüsyonu) 6 μg/ml PB veya optimize edilmiş CS/PB konsantrasyonu kullanarak gece boyunca transduse edin.
2. Virüs içeren ortamı uzaklaştırın ve yerine taze ortam ekleyin. Hücreleri 2 gün inkübe ettikten sonra, floresan vektörler kullanarak FACS ile ve/veya transgen spesifik primerler ile RT-PCR üzerinden transgen ekspresyonunu doğrulayın.

6. Temsili sonuçlar:

Şekil 1A lentivirüs üretim sürecini, Şekil 1B ise murine retrovirüs reseptörü Slc7a1 ile ön transdüksiyonu da içeren, insan hücrelerinin ekotropik lentivirüs ile transdüksiyonunu göstermektedir. Virüs titrasyonu için, Slc7a1 ile stabil olarak transdükse edilmiş bir insan rabdomiyosarkom hücre hattı (Slc-hRMS) kullanıyoruz. Transdüksiyon verimliliğini izlemek için floresan kontrol vektörleri kullanıldığında, Şekil 2A ve 2B'de gösterildiği gibi, ekotropik virüs ile Slc-hRMS'nin > %90 transdüksiyon verimliliğine rutin olarak ulaşıyoruz. HDF'lerin transdüksiyon oranları, hücreler reseptör ekspresyonu için blastisidin ile seçilmediği için genellikle daha düşüktür (Şekil 2C). Ekotropik lentivirüs titreleri, Slc-hRMS üzerinde ölçüldüğünde genellikle VSV-psödotipli virüsün %10-20'si kadardır (Şekil 2D).

Bir dondurma-çözme döngüsü, ekotropik virüsün titresini %3 - 16 oranında düşürür; bu değer, VSV-psödotiplenmiş virüsün tek bir dondurma-çözme döngüsündeki titre kaybına eşittir (p > 0.05). Önceki raporların aksine,² kuru buzda şok dondurmanın virüs titresi üzerinde herhangi bir olumlu etkisi gözlemlemedik. Bunun yerine, virüs tüplerini basitçe -80°C'lik bir dondurucuya yerleştirerek her iki psödotip için daha yüksek çözdürme sonrası titreler elde ettik (veriler gösterilmemiştir).

MTT canlılık testi, hedef hücrelerdeki büyüme durmasının hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Virüs ile birlikte 800 μg/ml konsantrasyona kadar CS/PB ile yapılan transdüksiyonun HDF metabolizması üzerinde hiçbir etkisi yoktur (Şekil 3A). Virüs olmaksızın CS/PB'ye maruz kalmanın da hücreler üzerinde toksik bir etkisi yoktur (veriler gösterilmemiştir). Virüs ve çeşitli konsantrasyonlarda CS/PB ile transdükte edilen HDF'lerin FACS analizi, sadece PB'ye kıyasla transdüksiyonun arttığını göstermektedir (Şekil 3B). Maksimum artış, daha önce bildirilen değerlerden birkaç kat daha düşük olan 100 μg/ml CS/PB konsantrasyonunda gerçekleşmektedir (Şekil 3C).³ Bu nedenle, herhangi bir hedef hücre tipi için koşulların optimize edilmesi önemlidir.

CS/PB ile kompleksleme, Slc-hRMS'de gözlemlenen titreyi yaklaşık 3 kat artırır (Şekil 4A, p < 0.01). Pratikte bu durum, düşük virüs konsantrasyonlarında transdüksiyon verimliliği üzerinde, yüksek konsantrasyonlara göre daha belirgin bir etki yaratır (Şekil 4B); bu durum büyük olasılıkla yüksek virüs konsantrasyonlarındaki çoklu transdükte hücrelerden ve reseptör doygunluğundan kaynaklanmaktadır.

Ekotropik virüs ile transdüksiyon, fare retrovirüs reseptörü eksprese eden hücrelere özgüdür. Modifiye edilmemiş insan hücrelerine ekotropik virüs ile transdüksiyon yapıldığında, Şekil 5A'da gösterildiği üzere, PB veya CS/PB kullanımı fark etmeksizin, transdüksiyon yapılmamış arka plan düzeyinden daha yüksek bir floresan gözlemlenmemiştir. Mikroskobik olarak HDF'ler, reseptör yokluğunda transdüksiyon göstermezken (Şekil 5B), reseptör ile ön transdüksiyon yapılması floresan hücrelerle sonuçlanmaktadır (Şekil 5C).

Şekil 1. Şematik görünümü (A) virüs üretim süreci ve (B) İnsan hücrelerinin önce fare retrovirüs reseptörü ile, ardından ekotropik lentivirüs ile transduksiyonu.

Şekil 2. GFP kodlayan ekotropik lentivirüs ile insan hücrelerinin yüksek verimli transduksiyonu. Hücreler önceden murin retrovirüs reseptörü Slc7a1 ile transdukt edilmişti. (A) Slc7a1 için blastisidin ile seçilmiş insan rabdomiyosarkom hücre hattı (Slc-hRMS), GFP ile transdukt edilmiş (mavi) veya transdukt edilmemiş (pembe). (B) Ekotropik olarak transdukt edilmiş Slc-hRMS'nin floresan mikrografı (4X). (C) Ekotropik GFP lentivirüsü ile transdukt edilmiş (mavi) ve transdukt edilmemiş (pembe) HDF'ler; hücreler ekotropik transduksiyondan iki gün önce Slc7a1 ile transdukt edilmiştir. (D) Slc-hRMS üzerinde ölçülen VSV-G psödotiplenmiş ve ekotropik lentivirüs titresi.

Şekil 3. İnsan dermal fibroblastlerinde kondroitin sülfat/polybrene (CS/PB) konsantrasyonlarının optimizasyonu. (A) Sadece PB varlığında veya farklı CS/PB konsantrasyonlarında transdüksiyon sonrası MTT testi ile ölçülen HDF'lerin canlılığı. (B) Farklı CS/PB konsantrasyonları ile HDF'lerdeki transdüksiyon verimliliğinin artırılması, FACS ile ölçülmüştür. (C) Maksimum transdüksiyonun 100 μg/ml CS/PB'de gerçekleştiğini gösteren transdüksiyon artışının nicelleştirilmesi.

Şekil 4. 400 μg/ml CS/PB'nin ekotropik lentivirüs ile Slc-hRMS transduksiyonu üzerindeki etkisi. (A) Titre artışı ve (B) tek başına 6 μg/ml polybrene ile karşılaştırıldığında transduksiyon hızındaki kat değişimi.

Şekil 5. Murine retrovirüs reseptörü Slc7a1 yokluğunda HDF'lerin ekotropik transduksiyon eksikliği. (A) Her iki durumda da reseptör Slc7a1 yokluğunda, transduksiyon yapılmamış (pembe) veya ekotropik GFP lentivirüsü ile transduksiyon yapılmış (mavi) BJ insan fibroblastlarının FACS grafiği. Reseptör Slc7a1 ile ön transduksiyon yapılmadan (B) ve yapıldıktan (C) sonra (4X), ekotropik GFP lentivirüsü ile transduksiyon yapılmış BJ insan fibroblastları.

Tartışma

Moloney fare lösemi virüsü (MLV) ve onun reseptörü mSlc7a1 dayalı Rekombinant ecotropic gammaretrovirus iyi çalışılmış ve yaygın olarak kullanılabilir, fare hücreleri transgenlerin sunmak için 20 yılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Ecotropic gammaretrovirus insan hücrelerine onkogenler sunmak için de son zamanlarda daha çok olmuştur. Hücresel yeniden programlama bağlamında, mSlc7a1 kullanımı iyi kurulmuş amphotropic virüs barındıran insan onkogenler nesil önlemek için ^4,5 Ancak, lentivirüs gammaretrovirus göre önemli avantajlar sağlar lentiviral ön-entegrasyon kompleksi sağlar çünkü refrakter hücre popülasyonlarının, sık sık yeniden programlama için arzu edilen ^{hedeflere 6} dahil birincil hücreler, uyum olmayan bölünen hücreleri ^{transdüksiyon} 7

Lentiviruses MLV virüs tropizm, toksisite ve diğer özellikleri ⁸ MLV pseudotyped ecotropic lentivirüs fare hücreleri, ⁹ uyum sağlamak olmuştur ama insan hücreleri üzerinde nadiren kullanılır olmuştur değiştirmek için bir çaba da dahil olmak üzere onlarca farklı pseudotypes, ile üretilmiştir ¹⁰ Bu nedenle, insan hücrelerinde hücresel yeniden programlama faktörler de dahil olmak üzere, bilinen ya da şüphelenilen onkogenler, teslim etmek için güvenli, uygun maliyetli ve yüksek verimli bir araç olarak MLV pseudotyped ecotropic lentivirüs kullanımını öneriyoruz.

Daha doğrusu, bu protokol, kanserle ilgili virüsleri ile self-aşılama potansiyel araştırmacılar, yalıtım, pantropic virüs onkogen (ler) ayırır; bu protokolü tamamen pantropic lentivirüs üretmek ve kullanmak gereksinimini ortadan kaldırmak olmadığını not etmek önemlidir. Protein mSlc7a1 ve insan homologu hSlc7a1 yayg amino asit taşıyıcıları bilinen Tümör Gelişimi veya alıcı hücreler üzerinde seçici bir büyüme avantajı tanımak yeteneği, ¹¹ amphotropic virüs içine dahil edilmesi için nispeten düşük riskli verme mSlc7a1 ile ifade edilir. Bu adım, gerekli biyogüvenlik düzeyi adanmış virüs veya doku kültürü tesisleri eksik laboratuvarlarda özellikle yararlı olabilir.

Bazı durumlarda pantropic virüsü hedef hücreleri doğrudan Slc7a1 plazmid transfecting kullanımı tamamen ortadan kaldırmak için mümkün olabilir, ancak bu tekniğin yararlı hedefler olacaktır birçok hücre transfeksiyon dirençli. Alternatif olarak, izole etme yeteneği blasticidin seçim hücreleri Slc7a1-transduced VSV-G pseudotyped lentivirüs ecotropic virüs bu hücrelerin çoğu için uyum sağlamak rutin olarak kullanılan bu tarihten sonra reseptör eksprese eden hücrelerin, bir stok oluşturmak için bir kez kullanılabileceği anlamına gelir deneyler. Araştırmacılar, her zaman tropizm ne olursa olsun, herhangi bir lentivirüs çalışan için kurumsal güvenlik yönergeleri takip etmelidir.

Bu protokol ile elde ecotropic virüs titreleri orta önceki çalışmalar ile anlaşma genellikle VSV pseudotyped virüs, pantropic virüs titresi% 10-20 daha düşüktür. ⁹ Bu titreleri stably Slc7a1 ile transduced insan hücrelerinde ölçüldü, bu nedenle alt ecotropic virüs için gözlenen titresi hedef hücrelere reseptör geninin çeşitli ifade kısmen olabilir. Bununla birlikte, protokolde elde viral titreleri çoğu uygulama için yeterli olandan daha fazla ve bazı durumlarda, hücrelerin çoğunluğunun transdüksiyon yol>% 90 hücre.

Santrifüj tabanlı teknikler genellikle viral parçacıkların konsantre kullanılır. Ancak, santrifüj, birkaç saat gerektirir infeksiyöz aerosollerin üretir ve viral parçacıkların önemli bir kaybına neden ^olabilir. 12, CS / PB ile kompleks bir alternatif olarak viral tropizm değiştirmeden transdüksiyon geliştirmek için ^{kullanılabilir.} 3 Bu yöntem (5 dakika hızlıdır gözlenen titresi yaklaşık üç katına ise, (10 ml virüs başına $ 0.03)) ve ucuz. Hiçbir özel ekipman veya tescilli reaktifler ve gerekli diğer hücre hatları önceki çalışma ile anlaşma, CS / PB HDFS maruz kaldıktan sonra en az akut toksisite gözlenen bu ^protokol 13 Bir potansiyel dezavantajı bazı mikroskobik görünür polimer kompleksleri uymasını kültür hücreleri birkaç gün. Biz bu kompleksleri, hücrelere açıkça zehirli olmasa da, hücresel süreçleri daha ince etkileri olabileceği olasılığını ekarte edemez.

Burada güvenli ve verimli bir şekilde onkojenik faktörleri ile insan hücrelerinin uyum için bir metodoloji tarif var. Bu yaklaşım, iPS hücreleri de dahil olmak üzere onkogenler ve kök hücre biyolojisi inceleyen araştırmacılar için harika bir yardımcı programdır olmalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Murin MLV reseptör
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G zarf
pCMV-dR8.91	D. Trono laboratuar 14		Ambalaj plazmid (eşdeğer plazmid psPax2 Addgene edinilebilir, Kedi Numarası 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Ecotropic zarf
FUGW	Addgene	14883	Plazmid GFP kontrolü
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimethrine bromür (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Kondroitin sülfat sodyum tuzu köpekbalığı kıkırdağı	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidin S	Balıkçı	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021