Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare lazer Doppler flowmetre Rehberlik İskemik İnme intraluminal Orta Serebral Arter Tıkanıklığı (MCAO) Model

51.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/2879

⸱

8 Mayıs 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Intraluminal orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli deneysel iskemik inme modelleri arasında en sık kullanılan model. Burada Lazer Doppler flowmetre kılavuzu ile ayrıntılı olarak tüm model ve onun temsilcisi sonuçları gösterecektir.

Özet

İnme, 1,2 2009 yılında Amerika Birleşik Devletleri 70 milyar ABD doları yakın bir tahmini maliyeti, üçüncü önde gelen ölüm nedeni ve özürlülük dünyanın önde gelen nedenidir. Koizumi 4 sıçan bu etkileyici insan patoloji simüle etmek için 1986 yılında intraluminal orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli geliştirilmiştir. MCAO yöntemi bir değişiklik daha sonra Longa 3 tarafından takdim edildi. Her iki teknikte de yaygın iskemik inme ve olası tedavi yöntemleri 5 kaynaklanan beyin hasarının moleküler mekanizmaları tanımlamak için kullanılmaktadır. Bu nispeten noninvaziv bir metod sıçanlarda, farelerde transgenik ve nakavt suşları 6,7 yararlanmak kullanmak uzatıldı . Fokal serebral iskemi modeli için, intraluminal sütür internal karotid arter yoluyla MCA tabanı kapamak için ileri düzeydedir. Katlanması zaman belirli bir süre sonra dikiş spontan reperfüzyon taklit eder, ancak sütür de kalıcı olarak muhafaza edilebilir. Bu video, kademeli bir biçimde farelerde intraluminal MCAO prosedürü gerçekleştirmek için iki ana yaklaşım gösteren yanı sıra potansiyel sakıncaları ve tuzaklar anlayışlar olacaktır. Iskemik beyin dokusu daha sonra beyin enfarktüsü 8 ölçüde değerlendirmek için 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) ile boyanan olacaktır .

Protokol

Bu protokol, Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Florida Üniversitesi'nde Komitesi (IACUC) kullanın ve "Laboratuvar Hayvanları Bakım ilkesi" (NIH yayın No 86-23, 1985 revize) ile uyum içerisindedir.

1. Malzemeler

  1. Hayvanlar: cerrahi anda 20-26 gram ağırlığında Erkek C57BL / 6 fareler (Harlan Laboratuvarları, Indianapolis, IN, ABD).
  2. Anestezi:
    1. Anestezi makinesi: VetEquip inhalasyon anestezi sistemi (VetEquip A.Ş., Pleasanton, CA, USA).
    2. Anestezik Soluma: İsofluranın (Baxter İlaç, Deerfield, IL).
  3. Cerrahi araçları: SUPERCUT Iris makas, düz (Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD); Vannas mikro-makas, düz (Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD); Dumont forseps (ince uçlu, 45 ° bükülmüş ipuçları, Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD); Bipolar koagülasyon birimi (Yüksek Frekanslı Desikatör 900, Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD), mikro damar klip (Dünya Hassas Aletler A.Ş., Sarasota, FL, ABD)
  4. Cerrahi malzemeler: Steril pamuk ipuçları; Mendil, tül süngerler; Sütür (dikiş 7-0 İpek, Ethicon, Inc, Somerville, NJ, ABD); Doku yapıştırıcı (Vetbond, 3M Company, St Paul, MN, ABD); Cerrahi fırçalayın : Bethadine,% 70 etanol ve steril salin% 0.9; Göz merhemi (Puralube Veteriner Merhem, Pharmaderm, Melville, NY, ABD).
  5. Tıkanıklığı sütür MCAO için hazırlanması:
    1. MCA oklüzyonu Filament: 7-0 cerrahi naylon monofilament sütür (Ethicon, Inc, Somerville, NJ, ABD).
    2. Isı kaynağı sütür ucu (Termal Koter Birimi, Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL) küntleşme.
    3. Sıvı silikon kauçuk (Silikon RTV yapıştırıcı, Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD).
  6. / Cerrahi mikroskop Diseksiyon (Leica Stereo Mikroskop MZ6).
    1. Fiber optik aydınlatma (Fiber Optik aydınlatma FO1-150, TechniQuip Corp Livermore, CA, USA).
  7. Lazer Doppler flowmetre (PeriFlux Sistemi 5000 Perimed, Stockholm, İsveç).
    1. Esnek mikrotip (MT B500-0 Düz mikrotip, Perimed, Stockholm, İsveç)
  8. Isı parametreleri:
    1. Rektal ısı monitörü (BAT-12, Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL).
    2. Termal battaniye (T / POMPA, TP600, Gaymar, NY, ABD).
  9. Boyama ve hacim infarkt kantitatif ölçümü:
    1. % 2 solüsyon 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (2% TTC, Sigma-Aldrich Co-St Louis, MO, ABD).
    2. Fareler beyin matris dilimleme makinesi (Zivic-Miller Lab. Inc, Allison Park, PA, USA).
    3. Dijital fotoğraf makinesi (V1253, Kodak Co, Rochester, NY, ABD).
    4. Görüntü J yazılımı (ImageJ 1.42q yazılımı, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MA, ABD).

2. Cerrahi öncesi adımlar

  1. Ameliyat öncesinde, farelerin, su ve kemirgen yemi ücretsiz erişim ile 12:12 ışık / karanlık döngüsü altında muhafaza edilir.
  2. (7-0 kuru izin MCAO için Dikişler, ısı ve ucundan sıvı silikon kauçuk kaplama dikiş şaft 3-4mm ile sütür ucu 1-2mm küntleşme tarafından hazırlanan; ucu çapı, 0.20-0.25mm; kaplama uzunluğunda, 3-4mm; dikiş uzunluğu 11-13mm). Sterilite, söz konusu adımların tüm korunmuş olması gerekir.
  3. Fare ağırlığında sonra, anestezi indüksiyon odasında izofluran% 4 ile indüklenen ve% 30 O 2 ve% 70 N 2 O gaz karışımı bir yüz maskesi ile% 1.5-2 izofluran ile prosedür boyunca sürdürülmüştür.
  4. Fare (termal battaniye) sıcaklık kontrollü bir işletim yüzey üzerinde duran bir gazlı bez üzerine yüzükoyun pozisyonda yerleştirilir; baş kürk traş.
  5. Yağ oftalmik merhem iki göz için uygulanır ve göz kapaklarının cerrahi işlemi sırasında göz kuruma önlemek için kapalı.
  6. Nasion ve cilt esnek bir mikrotip (0.5mm çap MT B500-0 Düz mikrotip) yapıştırmayın yanal çekilir üstün ense hattan kalvaryumda örten cilt üzerinde orta hat insizyonu (1 cm) yapılır. Mikrotip lazer Doppler flowmetre MCA topraklarında kan akışını izlemek için sağ parietal kafatası yüzeyi (1 mm arka ve bregma lateral 5 mm) dik olarak yerleştirilir.
  7. Hayvan supin pozisyonda açılmadan önce esnek mikrotip kafatasına sıkıca takılı olduğundan emin olun. Hayvanın boyun yumuşak bir yastık yerleştirilir ve burun burun konisi anestezi cihazların tutulur. Bu esnek mikrotip için yeterli alana sahip neden olacaktır.
  8. Rektal ısı probu 37 ± 0.5 ° C sabit bir hayvan çekirdek sıcaklığını korumak için eklenir
  9. Her iki forepaws ve hindpaws işletim platformu yüzeye bantlanmış ve kuyruk rektal tüp bantlanmış.

    10. 3. MCA oklüzyonu cerrahisi:

    1. Operasyon mikroskobu altında, orta hat boyun insizyonu gevşek deri hafifçe kaldırarak manubrium ve çene arasındaki makas ile yapılır.
    2. In situ sol sol bezi ile eşleştirilmiş yatan submandibular bezlerin açık açık ayrılır. Sağ submandibular bezi cranially retrakte ve sternokleidomastoid kas ile birlikte güvence altına alınmıştır.
    3. Carotica'nın kapsayan omohyoid kas maruz kalan bölümü dikkatle manyetikler ile ayrılmıştır.
    4. Sağ karotis arter (CCA), vagus siniri ve kılıf (CCA lateralinde bulunan) dikkatlice ayrılmış ve izole edilmiştir.
    5. Bundan sonra, farklı MCA oklüzyonu gerçekleştirmek için sık sık kullanılan 2 cerrahi yöntemler :

    Koizumi Kullanıcı 4 yöntem

    1. Üç gevşek yakalı sütür (7-0 ipek) sağ CCA etrafında hazırlanmıştır.
    2. Eksternal karotid arter (ECA), tespit izole ve koterize (bifurkasyon için distal 2-3mm). Bu daha sonra mikro makas ile ayrılabilir. Koterizasyon yerinde yanlışlıkla periferik hasarları önlemek için, güç, güç düğmesini kullanarak 1 ayarlanmış olmalıdır. Bu tüm cauterizations için tutarlı.
    3. Yeterli gerilim, kan akımı (kalıcı ligasyonu) CCA kapamak için en proksimal yaka dikiş uygulanır. Akış tıkanma temel kortikal perfüzyon değerlerinin ~ 50% düşüş tarafından doğrulanmadı.
    4. Sonra bir gemi klibi arteriyotomi zaman retrograd akışını önlemek için sadece CCA çatallanma önce yerleştirilir.
    5. Bir arteriyotomi mikro-makas (yakın ligasyonu) ile proksimal bağlandı dikiş ve CCA damar klip arasında yapılır.
    6. Arteriyotomi ısı köreldiğini silikon kaplı 7-0 naylon sütür ile tanıştırdı ve damar klip ulaşana kadar gelişmiş. Arter duvarında travmatize dikkatli, CCA üzerinden akış kaçağı önlemek için arteriyotomi ve damar klip arasında CCA çevresinde kalan 2 gevşek yakalı sütür hafifçe sıkılır, daha sonra damar klip çekilmiş.

    Longa Kullanıcı 3 yöntem

    1. ECA, tespit koterize (1 gücü ile), (dilli ve maksiller arterlerin ayrılmasından yakınında) mümkün olduğu kadar disseke ve mikro-makas ile bölünmüş.
    2. İki gevşek yakalı sütür (7-0 ipek) CCA çatallanma sadece yukarıda proksimal ICA çevresinde hazırlanmıştır.
    3. CCA geçici bir gemi klibi ile kapatılır. Akış tıkanma temel kortikal perfüzyon değerlerinin ~ 50% düşüş tarafından doğrulanmadı.
    4. Sonra ICA arteriyotomi zaman retrograd akışını önlemek için iki gevşek yakalı sütür üzerinde bir gemi klip ile geçici olarak kapatıldı.
    5. Güdük yansıyan ECA yakın bir arteriyotomi mikro-makas kullanılarak yapılır.
    6. ECA arteriyotomi ısı köreldiğini silikon kaplı 7-0 naylon sütür ile tanıştırdı ve ICA uygulanan damar klip ulaşana kadar gelişmiş. Proksimal ICA 2 gevşek yakalı sütür, arter duvarındaki travmatize yeterince ilgi, ICA reflü kan akışını önlemek için proksimal ICA etrafında hafifçe sıkılır, daha sonra damar klip çekilmiş.

    Prosedürün geri kalanı büyük ölçüde yakınsak:

    1. Hafif bir direnç hissedilir kadar kapatılmasıy sütür internal karotis arter (ICA) kafa tabanına doğru yavaş yavaş ilerlemiştir. Serebral kan akımı değeri başlangıca göre bir yüzdesi (% 80) olarak eşzamanlı açılan lazer Doppler flowmetre tarafından teyit edilir. 2 yaka sütür eklenen filament etrafında sıkılır.
    2. Kapatılmasıy dikiş geçici serebral iskemi deneyleri için, 45 dakika sonra hafifçe geri çekilir. Bu zaman noktası, çeşitli deneysel amaçlar için değiştirilebilir.
    3. Arteriyotomi sitesinde dikiş filament çekilme sonra, ameliyat sonrası kanama önlemek için kapalı. Koizumi yöntemi, bu güvenli CCA etrafında yakalı sütür sıkma içerir. Longa tekniği, ECA üssünde arteriyotomi sitesi koterize, proksimal ICA yakalı dikişlerle sonra gevşedi ve karotis akışı geri kaldırılır.
    4. Insizyon kapatmak için, submandibular bezi ve SCM ameliyat alanın üzerine serilir. Yara kenarları sonra servikal doku yapıştırıcısı ve kafa derisi alanları ile yaklaştırılır. Alternatif olarak, emilebilen bir sütür veya metal zımba, hayvanın uzun süreli sağkalım amaçlanan, özellikle yara kapatmak için kullanılan olabilir.
    5. Kesi kapatılmasından sonra, hayvan hacmi ikmal olarak subkutan 1 ml ılık tuzlu su alır. Iyileşme döneminde hayvanın ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için uygun analjezik doz (0.05-0.1 mg / kg 'yani Buprenorfin) kullanılmalıdır. Animal cerrahi seti kaldırıldı ve yumuşak gıda ve su ücretsiz, kolay erişim, hipotermi önlemek için sıcak bir kurtarma alan / kafes yerleştirilir.

    4. Post-Op nörolojik değerlendirme

    3 aşağıdaki gibi, hayvan toplam bilinç kavuşur sonra nörolojik defisit basit bir ölçek (beş puanlık bir ölçek) tarafından değerlendirilmelidir.

    1. gözlemlenebilir açıkları yok
    2. kontralateral forepaw (hafif fokal nörolojik defisit) genişletmek için başarısızlık
    3. infarkt için kontralateral bir yön çizerek (orta fokal nörolojik defisit)
    4. infarkt kontralateral bir yön düşen (ciddi fokal nörolojik defisit)
    5. spontan hareket olmadan bilinç depresif

    5. Boyama ve beyin infarkt hacmi kantitatif ölçümü

    1. MCA reperfüzyon 24 saat sonra, hayatta kalan fare,% 4 isoflorane ile derin anestezi tartılır ve onaylanmış protokole göre kurban.
    2. Beyin dikkatle kaldırılır ve bir fare beyin matris dilimleyiciyi yerleştirilir ve 2 mm aralıklarla tüm serebrum koronal kesitli.
    3. Bölümleri TTC 37 fosfat tamponlu salin (PBS)% 2 ° C de 20 dakika boyunca dalmış. TTC boyama sonra, infracted alan kırmızı tuğla (canlı) doku (Şekil 1) bitişik bir beyaz (boyasız) doku olarak gösterilmiştir.
    4. Seri bölümleri, dijital kamera ve görüntü J programı ile ölçülür infarkt alanı kullanılarak fotoğraflandı.
    5. Infarkt alanı (beyaz, boyasız), ipsilateral hemisferde (lekeli, tuğla, beyaz ve kırmızı) alanında ve kontralateral hemisferde (kırmızı tuğla, vitray) alanında, her bölüm için ölçülür. Hacmi, tüm bölümlerde temsilcisi alanlarda toplayarak ve kesit kalınlığı ile çarpılarak hesaplanır. Ödemi düzelttikten sonra, enfarktüs hacmi 9 aşağıdaki gibi hesaplanır:
      Düzeltilmiş İnfarkt Hacmi (CIV),% = [kontralateral hemisfere hacmi - (ipsilateral yarımkürede hacmi - infarkt hacmi)] / kontralateral yarımkürede hacmi x 100

    6. Temsilcisi Sonuçlar

    Geçici serebral iskemi kurmak için sol CCA ile MCA oklüzyon ve reperfüzyon sonra, hayvanlar kurban ve onların koronal kesitli beyinleri infarkt hacmi (Şekil 1) değerlendirmek için TTC ile boyandı.

    figure-protocol-1
    Şekil 1 fareler TTC-lekeli seri koronal beyin bölümler (2 mm) MCA oklüzyonu tabi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

MCAO model fare türlerinde serebral iskemi çoğaltır kurulmuş bir model. Bu model ilk sıçanlarda kullanılır ve bundan sonra farelere adapte oldu. Kraniektomi kaçınmak, kan-beyin bariyeri geçirgenliği ve intrakranial basınç cerrahi manipülasyonu etkisini ortadan kaldırmak için bu tekniğin bir avantaj. Ancak, ilgili gerilim farklılıkları 10, 6, oklüzyon vücut ısısı 12, anestezi 13 sütür ucu 11, süresi büyüklüğü ve diğer faktörler gibi pek çok değişken, bu model infarkt hacimleri ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışmasından olduğunu beyan ederim.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifin Adı Tip Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
Erkek C57BL / 6 fareler Hayvan Harlan Laboratuvarları, Indianapolis, IN, ABD 20-26 gr
Diseksiyon mikroskobu Mikroskop Leica Stereo Mikroskop MZ6 6.3:1 zum
Fiber optik aydınlatma Aydınlatıcı TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA FO1-150
İsofluranın Anestezi Baxter İlaç, Deerfield, IL 1001936060
Iris makas düz SUPERCUT Cerrahi araç Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD 14218
Vannas mikro-makas, düz Cerrahi araç Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD 14003
Dumont ince ucu forseps Cerrahi araç Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD 503290
Gemi klip Cerrahi araç Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD 14120
Yüksek Frekans Desikatör 900 Cerrahi araç Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD 500397
7-0 cerrahi naylon monofilament sütür Dikiş Ethicon, Inc Somerville, NJ, ABD 1647G Oklüzyonu Sütür
7-0 cerrahi İpek sütür Dikiş Ethicon, Inc Somerville, NJ, ABD 7733G Ligasyonu için sütür
Silikon RTV yapıştırıcı Silikon kauçuk Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD 1571
Vetbond Doku yapıştırıcısı 3M Company, St Paul, MN, ABD 70200746587
Puralube Veteriner Merhem Göz merhemi Pharmaderm, Melville, NY, ABD
Buprenorfin hydrochlorode Analjezikler Hospira A.Ş., Lake Forest, IL, ABD NDC 0409-2012-32
Termal Koter Ünitesi Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD 501292
PeriFlux Sistemi 5000 TCD flowmetre Perimed, Stockholm, İsveç
BAT-12 Rektal termometre Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD Bat-12R
T / POMPA, TP600 Termal battaniye Gaymar, NY, ABD
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Reaktif Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, USA T8877
Fareler beyin matris dilimleme makinesi Beyin dilimleme makinesi Zivic-Miller Lab. Inc, Allison Park, PA, USA BSMAS001-1

Kaynaklar

  1. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).
  2. Lloyd-Jones, D. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, e21-e181 (2009).
  3. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).
  4. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  5. Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurol Res. 19, 641-648 (1997).
  6. Fujii, M. Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).
  7. Bederson, J. B. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).
  8. Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury. Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).
  9. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
  10. Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).
  11. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
  12. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

S t r Ok zyonuSerebral Enfarkt sTTC BoyamaN rolojik DefisitlerFare ModeliReperf zyon De erlendirmesi
Fare lazer Doppler flowmetre Rehberlik İskemik İnme intraluminal Orta Serebral Arter Tıkanıklığı (MCAO) Model
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.