$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. CRISPR aracılı temel düzenleme araçları kullanılarak BRCA1 varyantlarının oluşturulması
NOT: HAP1-BE3 hücre hatları kullanılmazsa, BE3 kodlayan plazmit DNA, BRCA1 hedefli gRNA ile birlikte transfekte edilebilir. BE3 ve gRNA plazmitlerinin birlikte transfeksiyonu ile karşılaştırıldığında, gRNA plazmitinin HAP-BE3 hücrelerine transfeksiyonu, ellerimizdeki hedef lokusta 3 kata kadar verimli baz düzenlemesini indükler.
- Transfeksiyondan 1 gün önce 24 oyuklu plakalarda oyuk başına 5 x 105 HAP1-BE3 hücresi (veya birlikte transfeksiyon yöntemleri durumunda HAP1 hücreleri) tohumlayın. Transfeksiyon sırasında, kültür hücreleri uygun bir yoğunluğa ulaşır (% 70 -% 80 birleşme).
- Üreticinin protokolüne göre satın alınan transfeksiyon reaktiflerini (Malzeme Tablosu) kullanarak BRCA1 hedefleme gRNA'larını transfekte edin. BRCA1 hedef bölgelerinde C:G'den T:A'ya dönüşümü indüklemek için 1 μg BRCA1 hedefli gRNA'lar (ko-transfeksiyon yöntemlerinde 1 μg BE3 kodlayan plazmit DNA ile) kullanın. Hücreleri 37 ° C'de inkübe edin ve her 3-4 günde bir alt kültür yapın.
- Baz düzenleme verimliliklerini analiz etmek için hücre peletlerini transfeksiyondan 3, 10 ve 24 gün sonra hasat edin (Transfeksiyondan 3 gün sonraki numuneler, 0. gün numuneleri olarak yeniden derecelendirilerek analiz edilir).
- Genomik DNA saflaştırma kitini kullanarak genomik DNA'yı çıkarın (Malzeme Tablosu).
NOT: Transfeksiyon koşullarını, reaktifin DNA'ya değişken oranı ile optimize etmenizi öneririz. HAP1 transfeksiyonu için en uygun koşul, elimizdeki reaktifin DNA'ya 4:1 oranında oranıdır.