Protein Fosforilasyon Analizi için Tek Moleküllü Aşağı Çekme Testi: Hücre Lizatında Protein Fosforilasyonunu Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

Abstract

Kaynak: Bailey, E. M. et al., Protein Fosforilasyonunun Miktar Tayini için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Aşağı Çekme Testi. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, tek moleküllü bir aşağı çekme testi kullanarak protein fosforilasyonunun hassas bir miktar belirleme tekniğini göstermektedir. Polietilen glikol-biyotinin işlevselleştirilmesi ve etiketli antikorların kullanılması, fosforile tirozinin özgüllük ile saptanmasını arttırır.

Protocol

1. Dizinin biyotinile antikor ile işlevselleştirilmesi

1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
   1. T50 Tamponu, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 50 mM NaCl'den oluşan bir çözelti. Çözüm, RT'de 1 ay boyunca stabildir.
   2. T50 tamponunu 0.1 mg / mL BSA ile takviye ederek T50-BSA. Hazırlanan çözeltiyi buz üzerinde tutun.
   3. 1x PBS'de 10 mg / mL sodyum borhidrür (NaBH₄). Bunu kullanmadan hemen önce hazırlayın.
   4. T50 tamponunda 0.2 mg / mL NeutrAvidin (Malzeme Tablosuna bakınız).
      Dikkat: NaBH₄ indirgeyici bir ajandır ve yanıcıdır. Kullandıktan sonra kabı daima nitrojen gazı ile boşaltın ve bir desikatörde saklayın.
2. Diziyi biyotinile antikor ile işlevselleştirin.
   1. PEG-biotin işlevselleştirilmiş dizileri dondurucudan çıkarın ve açmadan önce konik boruyu RT'ye dengeleyin. Lameli dizilim yukarı bakacak şekilde sızdırmazlık filmi kaplı 100 mm doku kültürü (TC100) kabına yerleştirin.
      not: Üstten aydınlatmayı en aza indirin. Tüm çözümler, hidrofobik dizi tarafından tanımlanan kareler üzerinde "boncuklanmalı". Her kareyi tamamen kaplayacak şekilde (tipik olarak 10-15 μL) uygun bir çözelti hacmi ekleyin ve sıvının tanımlanan alandan taşmasına izin vermeyin. Sıvıları hızlı bir şekilde çıkarmak için, atıkları yakalamak için bir vakum şişesine bağlı bir kurum içi vakum hattı kullanın. Tüpü kimyasal davlumbazda açık bırakarak NaBH_4'ün atılmadan önce 1 saat gazdan arındırılmasına izin verin. NaBH₄ işlemi, arka plan otofloresansını azaltmak ve böylece yanlış pozitif tek molekül tespitlerini azaltmak için gereklidir.
   2. Dizinin her karesine RT'de 4 dakika boyunca 1x PBS'de 10 mg / mL NaBH₄ uygulayın. PBS ile üç kez yıkayın.
   3. Her kareyi T50'de 0.2 mg / mL NeutrAvidin ile 5 dakika inkübe edin. T50-BSA.
      ile üç kez yıkayın not: NeutrAvidin, PEG-biotin'e bağlanır ve biyotinile antikorlar için bir bağlanma bölgesi sağlar.
   4. T50-BSA'da 2 μg / mL biyotinile POI spesifik antikor ile her kareyi 10 dakika inkübe edin; T50-BSA ile üç kez yıkayın.
      not: Mevcut protokol, EGFR-GFP'yi yakalamak için biyotinile edilmiş anti-EGFR IgG (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanır.

2. Tam hücre lizatlarından POI SiMPull

>NOT: İşlevselleştirilmiş SiMPull dizilerinden oluşan TC100 kabını, SiMPull hazırlığının geri kalanı için buzun üzerine yerleştirin. Bu adım, bir POI'nin toplam protein lizatından aşağı çekilmesidir. Lizat çözüldükten sonra tekrar kullanılmamalıdır.

1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
   1. 1x PBS'de %4 paraformaldehit (PFA)/%0.1 glutaraldehit (GA) hazırlayın.
      Dikkat: PFA ve GA toksik kimyasal fiksatifler ve potansiyel kanserojenlerdir. KKD giyin. Kimyasalları yerel yönetmeliklere ve yönergelere göre tehlikeli atık olarak atın.
   2. 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 hazırlayın.
2. Lizatı hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek çözün ve karıştırın. Buz üzerinde tutun.
3. 1 μL lizatı 100 μL buz gibi soğuk T50-BSA/PPI.
   not: Gerekirse, diziye bir dizi seyreltme uygulayarak toplam protein lizatının uygun seyreltme faktörünü belirleyin. Dizi alanı başına SiMPull reseptörlerinin optimal yoğunluğu 0.04-0.08/^μm2'dir.
4. Lizatı dizideki 10 dakika boyunca inkübe edin; daha sonra buz gibi soğuk T50-BSA / PPI ile dört kez yıkayın.
5. AF647 konjuge anti-fosfotirozin antikorunu (Malzeme Tablosuna bakınız) buz gibi T50-BSA / PPI içinde seyreltin ve dizi üzerinde 1 h.
   not: Mevcut protokolde, EGFR-GFP'nin fosforile popülasyonunu tanımlamak için bir pan anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG kullanılmaktadır. Doğrudan etiketli antikorların kullanılması, ikincil antikorlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır, etiketleme seçeneklerini arttırır ve sonuçların tutarlılığını iyileştirir. Floresan işaretli antikorlar ticari kaynaklardan elde edilebilir. Ticari olarak mevcut değilse, antikorlar standart biyokonjugasyon teknikleri kullanılarak özel olarak etiketlenebilir ve ticari biyokonjugasyon kitleri mevcuttur. Floresan olarak etiketlenmiş antikorların her bir partisinin, bir doz eğrisini ölçmek ve doyma noktasını bulmak için SiMPull gerçekleştirilerek optimal etiketleme koşulları için test edilmesi gerekir.
6. Buz gibi T50-BSA ile toplam 6-8 dakika boyunca altı kez yıkayın.
7. Buz gibi 1x PBS ile iki kez yıkayın.
8. Antikor ayrışmasını önlemek için diziyi %4 PFA/%0.1 GA çözeltisi ile 10 dakika inkübe edin.
9. Fiksatifleri etkisiz hale getirmek için her biri 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 / PBS ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
   not: Birden fazla antikor kullanan deneyler için (örneğin, birden fazla fosfotirozin bölgesini tespit etmek), 2.5-2.9 adımlarını tekrarlayın.

3. Görüntü elde etme

>NOT: Tek moleküllü görüntü elde etme, 150x TIRF objektif ve emCCD kameranın belirli bir çeyreğindeki her bir spektral kanalı yakalayan bir görüntü ayırıcı kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Kalibrasyon görüntüleri ilk olarak, 3 ila 1 μm (toplam boyut ~60 μm × 60 μm) delik içi mesafede 200 ± 50 nm deliklerden oluşan 20 x 20 dizi içeren nanodesenli bir kanal hizalama ızgarası (nanogrid) ile kanal kaydına ± kamera kazanç kalibrasyonuna izin vermek için elde edilir.

1. Aşağıdaki adımları izleyerek kanal kaydını gerçekleştirin.
   not: Yayıcıların kolokalizasyonunu doğru bir şekilde hesaplamak için doğru kanal kaydı gereklidir. Bu adım çok önemlidir.
   1. Yağ objektifini temizleyin ve objektif üzerine bir damla yağ bırakın. Nanogrid'i görüntüleme için sahneye yerleştirin. İletilen beyaz ışığı kullanarak ızgara desenine odaklanın.
      not: Nanogrid ile görüntüler, nanogridden geçen ve tüm spektral kanallarda tespit edilen iletilen ışık kullanılarak elde edilir. Alternatif olarak, her kanalda tespit edilen floresan yayan multifloresan boncuklar kullanılabilir. Görüntü alımının her mikroskop kurulumuna göre optimize edilmesi gerekecektir.
   2. Izgaranın 20 görüntüsünden oluşan bir dizi elde edin. Piksellerin doygun olmadığından emin olun. Görüntü serisini "Fiducial" olarak kaydedin.
   3. Havadar bir desen oluşturmak için nanogrid'in odağını bozun. Kazanç kalibrasyonları için bir dizi 20 görüntü elde edin. Görüntüyü "Kazanç" olarak kaydedin.
   4. Tüm ışığın kameraya gitmesini engelleyerek kamera ofseti için 20 görüntüden oluşan bir seri elde edin. Resmi "Arka Plan" olarak kaydedin.
2. SiMPull images.
   edinin not: Lamel dizisini görüntülemeden önce, Tris çözümünü T50-BSA ile değiştirin ve diziyi RT olarak dengeleyin.
   1. Yağ objektifini temizleyin ve objektif üzerine ilave yağ bırakın. Lamel dizisini mikroskop tablasına sabitleyin.
   2. Her floroforun uyarma gücünü, TIRF açısını ve kamera entegrasyon süresini optimize edin. Amaç, numunenin foto-ağartılmasını en aza indirirken en yüksek sinyal-gürültü elde etmektir. Gelecekteki ölçümlerde tutarlılık için lazer gücünü kaydedin.
      not: Bu çalışmada uzak kırmızı kanal için 300 ms ve yeşil kanal için 1 s maruz kalma süresi kullanılmıştır. 642 nm lazer yaklaşık 500 μW lazer gücünde kullanılırken, tüp lensten önce ölçülen 488 nm lazer 860 μW'da kullanıldı.
   3. Her örnek için görüntü alın. Önce uzak kırmızı kanalı, ardından foto ağartmayı azaltmak için her bir düşük dalga boylu floroforu görüntüleyin. Her numune için kullanılan düşük hacim nedeniyle, tampon seviyesini her 30-45 dakikada bir kontrol edin ve gerektiğinde yenileyin.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri	MTC Biyografi	C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl			T50 Tampon
100 mm Doku Kültürü kabı	HÜCRE TEDAVİSİ	229620	Piranha kazınmış cam/dizilerin depolanması
15 mL konik tüp
% 16 Paraformaldehit Sulu Çözelti	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15710	tehlikeli
50 mL konik boru			İşlevselleştirilmiş Cam depolama / KOH yeniden kullanımı
% 8 Glutaraldehit Sulu Çözelti	Elektron Mikroskobu Bilimleri	16020	tehlikeli
Alexa Fluor 647 NHS Ester	Thermo Fisher Bilimsel	A-20006
Anti-İnsan EGFR (Dış Alan) – Biotin	Leinco Teknolojileri A.Ş	E101
Anti-p-Tyr Antikoru (PY99) Alexa Fluor 647	Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-7020 AF647
Biyotin-PEG	Laysan Biyografi	Biotin-PEG-SVA, MW 5.000
Sığır serum albümini	Altın Biyoteknoloji	A-420-1	Tyrode'un Tampon Bileşeni
Lamel 24 x 60 #1.5	Elektron Mikroskobu Bilimleri	63793
emCCD kamera	Andor iXon
Halt Fosfotaz ve Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100X)	Thermo Fisher Bilimsel	78446	Lizis Tampon Bileşeni
buz
Immersol 518F daldırma yağı	Zeiss	444960-0000-000
Kurum içi vakum hattı
Mix-n-Stain CF Boya Antikoru Etiketleme Kitleri	Biyotyum	92245
Nano şebeke	Miraloma Teknolojisi
NeutrAvidin Biotin Bağlayıcı Protein	Thermo Fisher Bilimsel	31000
Azot (sıkıştırılmış gaz)
Olympus iX71 Mikroskop	Olympus
Parafilm M Sızdırmazlık Filmi	Laboratuvar Deposu	HS234526C
PBS pH 7.4	Keson Laboratuvarları	PBL06
Fosfo-EGF Reseptörü (Tyr1068) (1H12) Fare mAb	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	2236BF
Dörtlü Görüntülü Görüntü Bölücü	Fotometri	Modeli: QV2
Semrock emisyon filtreleri: mavi (445/45 nm), yeşil (525/45 nm), kırmızı (600/37 nm), uzak kırmızı (685/40 nm)	Semrock Belediyesi	LF405 / 488/561 / 635-4X4M-B-000
Sodyum Borhidrür (NaBH4)	Kırlangıç Sigma	452874	tehlikeli