$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Düzlemsel Lipid Çift Katmanları
- Slaytların Plazma Temizliği
not: Plazma temizleme, organik kirleticileri giderir ve camın hidrofilikliğini artırarak verimli lipit adsorpsiyonu sağlar. Aşağıdaki adımlar, kullanılan plazma temizleyici ve cam lamellere bağlı olarak değişebilir veya optimize edilmesi gerekebilir.
- Hatlardaki ve haznedeki havayı çıkarmak için plazma temizleyiciyi 5 dakika boyunca oksijenle temizleyin. Bu, plazma temizleyici çalıştırıldığında, hatlarda ve haznede öncelikle oksijen olmasını sağlamak ve daha tutarlı iki katmanlı hazırlıklar sağlamak içindir.
- Temizleme sırasında, tozu ve partikülleri gidermek içinN2 veya Ar gibi inert bir gazı mikro kapak cam kızaklarının üzerinden akıtan.
opsiyonel: Kapak cam slaytları, her iki tarafa %100 izopropanol ve ardından su püskürtülerek yıkanabilir. İzopropanol-su yıkamasını 3 kez tekrarlayın ve ardından N2 akışı ile kurulayın.
- Kuru kapaklı cam slaytları seramik bir beşiğe yerleştirin. Kızağı, lameller haznenin uzun kenarına paralel olacak şekilde plazma haznesinin arkasına yerleştirin (bu, plazma temizliği sırasında onları yerinde tutar). Plazma temizleyiciyi maksimum güçte oksijenle 15 dakika çalıştırın.
- Oda Hazırlığı
not: Burada açıklanan yöntem, reaksiyon hacimlerini desteklemek için plastik PCR tüplerinden ev yapımı odalar kullanır, ancak silikon kuyular gibi diğer düşük yapışma özellikli malzemeler de uygun olabilir.
- Bir tıraş bıçağı veya makas kullanarak, 0.2 mL'lik bir PCR tüpünün buzlu kısmının hemen altındaki kapağı kesin (Şekil 1).
- PCR tüpünün kenarını UV ile aktive edilen yapıştırıcı ile boyayın ve tüpün içini önleyin. PCR tüp yapıştırıcısını, plazma ile temizlenmiş bir lamel ortasına nazikçe yerleştirin.
not: Haznenin içinde tutkal oluşmasını önlemek için, bir sızdırmazlık elde etmek için minimum miktarda yapıştırıcı kullanın ve hazneyi çarpmadan veya rahatsız etmeden hemen UV ile işlem yapın.
- Yapıştırıcıyı sertleştirmek için hazneyi 5-7 dakika boyunca uzun dalga boylu UV ışığı altına yerleştirin.
- İki Tabakalı Oluşum
not: Verimli çift tabaka oluşumu için bu adımda tek dağılımlı SUV'lar kullanılmalıdır. Tablo 1, stok ve nihai tampon konsantrasyonları dahil olmak üzere çift tabaka oluşumunda kullanılan tüm tamponlar için tarifler sağlar.
- 40 μL desteklenen lipid çift katmanlı tampon ekleyin (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM MgCl2; Tablo 1), 10 μL 5 mM SUV ve 1 μL 100 mM CaCl2 kuyuya. SUV'ları bozmak için hazneleri bir yandan diğer yana hafifçe sallayın ve ardından 37 °C'de 20 dk.
inkübe edin
not: Buharlaşmayı sınırlamak için, kapalı bir Petri kabında ıslak bir mendille inkübe edin.
- Fazla lipitlerin yıkanması
not: Bu adım, fazla SUV'ları ortadan kaldırır ve bir tampon değişim adımı görevi görür. Yıkarken çift tabakayı pipet ucu ile kazımamak çok önemlidir; Cam açığa çıkarsa, septinler ve diğer birçok protein geri dönüşümsüz olarak bağlanarak etkili protein konsantrasyonunu azaltır.
- İnkübasyondan sonra, iki tabakayı 6x 150 μL SLBB ile durulayın, kabarcıklardan kaçınırken her seferinde karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
NOT: 150 μL'yi doğrudan 50 μL'lik tampona ekleyin ve reaksiyon kuyusunda toplam 200 μL için zaten mevcut olan SUV'lar.
- Septinler veya tercih edilen farklı bir protein ile inkübe etmeye hazır olduğunuzda, iki tabakayı 6x 150 μL reaksiyon tamponu (RXN: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1.4 mg / mL BSA, %0.14 metilselüloz, 1 mM BME) ile yıkayın.
NOT: En iyi sonuçlar için, reaksiyon tamponunu taze yapın ve kabarcıkları önlemek için reaksiyonu iyice karıştırırken çok dikkatli olun.
- Son yıkama adımında, 125 μL reaksiyon tamponunu çıkarın ve 75 μL'yi kuyuda bırakın. İstenilen konsantrasyonda septin depolama tamponunda seyreltilmiş 25 μL septin ekleyin (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM BME) ve TIRF mikroskobu ile görüntü.
not: Bu testi ilk kez kurarken veya yeni bir lipit bileşimi eklerken, foto ağartma (FRAP) sonrası floresan geri kazanımı kullanarak lipitlerin yüzeyde serbestçe yayılmasını sağlamak iyi bir uygulamadır. Geri kazanım oranı, farklı lipid bileşimleri için farklı ve doğal olarak bağımsız sistemlerden daha düşük olsa da, lipitler hareketsiz olmamalıdır.
Tablo 1: Desteklenen lipid çift tabakasının ve reaksiyonların hazırlanması için tampon bileşenleri. Tamponlara dahil edilen stok çözeltilerinin hacimleri ve her bir bileşenin nihai konsantrasyonları gösterilir. SLB ve PRB oda sıcaklığında saklanabilir ve deneyler arasında tekrar kullanılabilir. Reaksiyon tamponu ve SSB her deney için taze yapılır.
| >Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Tampon (SLBB) |
| stok | hacim | Son konsantrasyon |
| 2 milyon KCl | 1,5 mL | 300 mM |
| 1 M HEPES | 200 μL | 20 milyon |
| 500 mM MgCl2 | 20 μL | 1 milyon |
| Su | 8 mL | |
| Ön Reaksiyon Tamponu (PRB) |
| stok | hacim | Son konsantrasyon |
| 2 milyon KCl | 166 μL | 33,3 milyon |
| 1 M HEPES | 500 μL | 50 milyon |
| Su | 9,33 mL | |
| >Reaksiyon Tamponu |
| stok | hacim | Son konsantrasyon |
| 2 milyon KCl | 166 μL | 33,3 milyon |
| 1 M HEPES | 300 μL | 50 milyon |
| 10 mg / mL BSA | 1.39 mL | 1.39 mg / mL |
| % 1 Metilselüloz | 1.39 mL | 0,0014 |
| Su | 10 mL'ye kadar | |
| Bme | 0,7 μL | 1 milyon |
| septin Depolama Tamponu (SSB) |
| stok | hacim | Son konsantrasyon |
| 2 milyon KCl | 1,5 mL | 300 mM |
| 1 M HEPES | 500 μL | 50 milyon |
| Su | 10 mL'ye kadar | |
| Bme | 0,7 μL | 1 milyon |
