Küresel Destekli Lipid Çift Tabakalı Deney: Mikroküreler Üzerinde Septin Düzeneğini Gözlemlemek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Curtis, B. N. ve diğerleri, Biyofiziksel Özellikleri ve Fonksiyonları İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Sulandırılması. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, lipid çift katmanları ile kaplanmış mikroküreler üzerinde septin protein düzeneğini inceleme tekniğini açıklar. Bu teknik, eğri yüzeyler üzerindeki eğriliğe bağlı protein düzeneklerinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Protokol

1. Küresel destekli lipid çift katmanları

NOT: Bu protokol, %10 yoğunlukta ultra saf suda asılı duran silika mikroküreler kullanır. Protein düzeneğinin kinetik parametreleri üzerine yapılan herhangi bir çalışma için, deneyler ve eğrilikler arasındaki toplam zar yüzey alanını sıkı bir şekilde kontrol etmek önemlidir. Tablo 1, toplam membran yüzey alanının 5^mm2'sini korumak için düzeltilmiş boncuk ve tampon hacimlerini göstermektedir.

1. Çift tabakalı oluşum
   not: Düzlemsel çift katmanlara gelince, sağlam çift katman oluşumu için yüksek kaliteli SUV'lara sahip olmak önemlidir. Tablo 1, %10'luk bir yoğunluk çözeltisinden elde edilen boncukların hacmini ve bir dizi boncuk çapı için 5^mm2'lik bir nihai yüzey alanı elde etmek için kullanılan ilgili SLBB hacimlerini listeler.
   1. Silika mikroküreler (boncuklar olarak da adlandırılır) bir araya gelme ve topaklanma eğilimindedir; boncukları karıştırmak ve herhangi bir kümeyi parçalamak için, şişeyi 15 saniye boyunca vorteksleyin, daha sonra 1 dakika boyunca banyo sonikasyonu yapın ve 15 saniye boyunca tekrar girdap yapın.
   2. Uygun boncuk hacmini (Tablo 1) karşılık gelen hacimde SLBB ve 10 μL 5 mM SUV ile 0,5 mL'lik düşük yapışmalı bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın.
   3. Boncuk-lipit karışımını oda sıcaklığında 1 saat boyunca uç uca sallayın. Sedimantasyonu önlemek için bu inkübasyonun bir döndürücü üzerinde yapıldığından emin olun.
2. PEGile lameller üzerinde odalar hazırlayın
   not: Düzlemsel çift katmanlara gelince, reaksiyon hacimlerini desteklemek için plastik PCR tüplerinden ev yapımı odalar kullanılır, ancak silikon kuyular gibi diğer düşük yapışma özelliğine sahip malzemeler de aynı şekilde çalışabilir.
   1. Boncuklar sallanırken, oda sıcaklığında PEGile edilmiş bir lamel çözdürün. 0.2 mL'lik bir PCR tüpü kesin ve açıklandığı gibi lamel üzerine yapıştırın. 24 mm x 50 mm'lik slaytlar için, bir slayta 10 adede kadar hazne uygun şekilde sığabilir.
      not: Bu protokolde önceden hazırlanmış 24 mm x 50 mm PEGile cam lameller kullanılır. Kısaca, cam lameller aseton, metanol ve 3 M KOH'da sonikasyon yoluyla iyice temizlenir. Lameller daha sonra n-2-aminoetil-3-aminopropiltrimetoksisilan ile işlevselleştirilir ve mPEG süksinimidil valerat ile kovalent olarak bağlanır. Bitmiş PE ile lameller -80 °C'de vakumlu olarak saklanır. Burada PEGile cam lameller önerilse de, BSA veya poli-L-lizin yöntemleri gibi diğer pasivasyon yöntemleri etkili olabilir.
3. Fazla lipitlerin yıkanması
   not: Bu adım, fazla SUV'ları çıkarmak ve bir tampon değişimi gerçekleştirmek için işlev görür. Boncuklar ön reaksiyon tamponu ile toplam 4 kez yıkanır (PRB: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4). Tablo 2, bir dizi boncuk çapı için RCF'deki dönüş hızlarını listeler.
   1. Boncukları belirlenen RCF'de 30 saniye boyunca döndürün (Tablo 2). Birden fazla boncuk boyutu kullanıyorsanız, boncukları yıkama zamanı gelene kadar sallanmaya devam edin.
      not: Zamandan tasarruf etmek için daha küçük boncuk sedimantasyon hızına sahip daha küçük boncuklarla aynı dönüşte daha büyük boncukları çökeltmeye değmez. Bu, boncukların birbirine yapışmasına ve çift katmanın bütünlüğünü tehlikeye atmasına neden olabilir.
   2. İlk dönüşten sonra, 50 μL süpernatan çıkarın ve 200 μL PRB ekleyin. İkinci ve üçüncü dönüşlerden sonra 200 μL çıkarın ve 200 μL PRB ekleyin. Dördüncü dönüşten sonra 200 μL çıkarın ve 220 μL PRB ekleyin. Her yıkama için kuvvetlice pipetleyin.
      not: Son yeniden süspansiyon hacmi, yıkamalardan farklıdır. Lipitlerle inkübe edildikten sonra boncukları girdaplamayın, çünkü bu çift katmanlarda boşluklar bırakabilir. Diğer boncuk boyutlarıyla çalışırken veya testin diğer parçalarını ayarlarken çökelmeyi önlemek için, boncuk karışımlarını uçtan uca döndürücüye geri yerleştirin.
4. Reaksiyonun hazırlanması
   1. Birden fazla boncuk boyutuna sahip bir rekabet tahlili yapıyorsanız, her boncuk boyutundan eşit hacimlerde karıştırarak 1:1 karışım yapın. Ardından, istenen boncuk karışımının 29 μL'sini (veya tek bir boncuğun) 721 μL RXN tamponu ile karıştırın.
      not: Yoğun boncuk kümelerini önlemek için boncukları her adımda bir pipetle iyice karıştırmak önemlidir; Bu, daha eşit bir boncuk dağılımı ve doğru toplam yüzey alanı ile sonuçlanacaktır.
   2. 75 μL seyreltilmiş boncuk ve SSB içinde seyreltilmiş 25 μL proteini kuyucuklara karıştırın.
      not: Yazarlar tipik olarak maya septin komplekslerini 1-50 nM'de görüntülerler.
   3. Septinleri sabit bir durumda ölçüyorsanız, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin ve ardından TIRF'ye yakın veya konfokal mikroskopi ile görüntüleyin.
      not: Bu reaksiyon, reaksiyonun toplam membran yüzey alanını 5^mm2'de korumak ve 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, %0.1 metilselüloz ve 1 mM BME'lik bir nihai reaksiyon koşulu üretmek için tasarlanmıştır.

Tablo 1: Normalleştirilmiş mikro küre hacimleri. Her boncuk boyutunun eşit bir yüzey alanını korumak ve toplam zar yüzey alanını deneyler arasında tutarlı tutmak için, toplam yüzey alanını normalleştiren her boncuk boyutu ve tampon için hacimler hesaplandı.

Boncuk Çapı (μm)	İyi karıştırılmış boncukların hacmi (μL)	SLB tamponunun hacmi (μL)	SUV hacmi (μL)
6,46	8,94	61,1	10
5,06	7	63	10
3,17	4,39	65,6	10
0,96	1,33	68,7	10
0,54	0,75	69,3	10
0,31	0,43	69,6	10

Tablo 2: Farklı çaplardaki mikroküreler için sedimantasyon hızları. Her boncuk çapı için, gösterilen minimum sedimantasyon hızları, bağlanmamış lipozomları yıkamak için boncukları peletlemek için kullanıldı

Boncuk çapı (μm)	Sedimantasyon hızı (RCF)
0,31	4.5
0,54	4.5
0,96	2.3
3,17	0,8
5,06	0,3

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Düz kapaklı 0.2 mL PCR Tüpleri, Doğal	Watson	137-211C(ESKI)
0,5 mL düşük yapışma özelliğine sahip tüpler	ABD Bilimsel	1405-2600
Beta merkaptoetanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
PEGile lameller yapmak için kapak camı	Termo Bilimsel	152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Kapak Camı 24x50 #1.5
DOPC (Türkçe)	Avanti Polar Lipidler	850375
Yumurta Liss Rhodamine PE	Avanti Polar Lipidler	810146
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Metil selüloz 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Mini santrifüj
İşlevselleştirilmemiş Silika Mikroküreler	Bangs Laboratuvarları A.Ş.	Boyuta bağlıdır: SS0200 * -SS0500 *	Sulu süspansiyon içinde silika
Optik Yapıştırıcı	Norland Thorlabs	HAYIR 68	Cam veya plastikler için esnek yapıştırıcı
Potasyum klorür	VWR (VWR)	0395-1KG
Sonikatör banyosu	Branson	1510R-MT	Bransonic Ultrasonik temizleyici. 50-60 Hz. Çıkış: 70W
Soya PI	Avanti Polar Lipidler	840044
Masa üstü santrifüj	Eppendorf Belediyesi	22331
UV Lambası	Spektralin	ENF-260C	115 Volt, 60 Hz, 0.20 AMPER

arası Gazetesi Serisi Gazetesi · Serisi Gazetesi