$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. İnsan kornea epitel hücre kültürü
- %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 37 ° C'de %5 CO 2.
NOT: Silkeleme gerekli değildir.
- Medyayı her 2-3 günde bir değiştirin.
2. Test için hücrelerin hazırlanması
- Hücreler neredeyse birleştikten sonra, kültür ortamını çıkarın.
- Her 75 cm²'lik şişeye 4-6 mL hücre ayrışma çözeltisi ekleyin. Hücreleri 37 °C'de, hücreler ayrılana kadar (yaklaşık 20-30 dakika) inkübe edin ve periyodik olarak mikroskop altında kontrol edin.
- Her 75 cm²'lik şişeye %10 FBS içeren 2-6 mL DMEM/F12 ekleyin.
- Şişenin içeriğini 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 450-500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı pipetleyin ve hücreleri önceden ısıtılmış ortamda yeniden süspanse edin.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Toplam 1 x 105 hücre içeren ortamın hacmini hesaplayın.
- 48 oyuklu kollajen-1 kaplı kültür plakasının her bir oyuğuna 1 x10 5 hücre ekleyin. Kuyuya yeterli miktarda ortam ekleyin, böylece kuyudaki son ortam hacmi %10 FBS.
ile 0,5 mL kültür DMEM/F12 olur
NOT: Yapay gözyaşı formülasyonu, HCEC'in metabolik aktivitesinde bir azalma ile ölçülebilen sitotoksisiteye neden olabilir. Verilerin tutarlılığı, tohumlama sırasında her kuyucuğa aynı sayıda HCEC eklenmesine bağlıdır. 48 oyuklu plaka için önerilen kültür konsantrasyonu 1 x 105'tir. Memeli hücreleri yeniden süspanse edildikten sonra santrifüj tüpüne yerleşebildiğinden, hücre süspansiyonunun HCEC'nin eşit olarak dağılması için plakaları hücrelerle tohumlarken hücrelerin sık sık çalkalayarak yeniden süspanse edilmesi önerilir.
- Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin.
3. Kurutma protokolü yok
- Kontrol prosedürü
- 24 saatlik inkübasyondan sonra kültür ortamını plakadan çıkarın.
- Hemen 150 μL'lik bir test formülasyonu ve ortam kontrol solüsyonu ile işlemden geçirin.
- Hücreleri 37 ° C ve% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin.
- Test çözeltilerini hücrelerden çıkarın.
- Metabolik aktiviteyi test etmek için 0.5 mL% 10 metabolik boya çözeltisi ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 4 saat daha inkübe edin.
- 4 saatlik inkübasyon süresinden sonra, her bir oyuktan 100 μL metabolik boya çözeltisini çıkarın ve her 100 μL'yi 96 oyuklu bir plakanın kuyucuğuna yerleştirin.
- Bir floresan plaka okuyucu (Malzeme Tablosu) kullanarak her kuyucuğun floresansını ölçün. Uyarma dalga boyunu 540 nm'ye ve emisyon dalga boyunu 590 nm'ye ayarlayın.
- Kurutma protokolü yok (geri kazanım prosedürü)
- 3.1.1−3.1.4 adımlarını tekrarlayın.
- Her oyuğa 0,5 mL DMEM / F12 ortamı ekleyin.
- Bir kültür setini 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 18 saat inkübe edin.
- Ortamı çıkarın ve 0,5 mL% 10 metabolik boya çözeltisi ekleyin. 3.1.6 ve 3.1.7 adımlarını tekrarlayın.