1. İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin Üretilmesi
- 6 oyuklu plakalarda% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM'deki insan fibroblastlarını kültürleyin.
- Fibroblastların yeniden programlanmasına başlamadan önce, 6 oyuğu Matrigel ile kaplayın ve oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edin. % 80 birleşmede, ortamı fibroblast kültürlerinden çıkarın ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın.
- Tüm plakayı kaplamak için yeterli% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- Hücreler kuyucuklardan ayrıldıktan sonra, tripsin sindirimini söndürmek için tripsin olarak% 10 FBS ile iki kat daha fazla DMEM ekleyin. Hücreleri parçalamak için hücre süspansiyonunu nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Bir hemositometre ile tek hücrelerin sayısını sayın.
- 7 x 105 hücreyi 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve elektroporasyon çözeltisinde hücre peletini yeniden süspanse edin. Fibroblastları üreticinin talimatlarına göre elektropoze edin. Hücreleri 100 μl elektroporasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve her epizomal vektörden 1 μg ekleyin. 1.650 V, 10 ms ve 3 zaman darbesi ayarlarına sahip hücreleri elektrostatik hale getirin.
- Hücre süspansiyonunu, 6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına %10 FBS ve plaka 5 x 104 hücre ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (DMEM) aktarın. Plakaları 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- 48 saat sonra, transfekte edilmiş fibroblast kültürlerinden ortamı çıkarın ve mTeSR ortamı ile değiştirin. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kolonileri izole edilmeye hazır olana kadar kültür ortamını günlük olarak değiştirin. iPSC kolonileri 28-35 gün sonra gözlenebilir.
- İzolasyon için hazır olduğunda, bir iPSC kolonisini mekanik olarak kesin ve 10 μM Rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü (Y-27632) ile mTeSR ortamında Matrigel kaplı 6 oyuklu bir plaka üzerine yeniden tohumlayın. Kültür ortamını günlük olarak değiştirin.
2. İnsan NPC'lerinin Nöral İndüksiyonu ve Bakımı
- iPSC kültürleri yaklaşık% 20 birleşim olduğunda, mTeSR ortamını çıkarın ve nöral indüksiyon ortamı ile değiştirin. Ortamı her iki günde bir yenileyin.
- 7 gün sonra, nöral indüksiyon ortamını çıkarın ve insan NPC bakım ortamıyla değiştirin. Kültürleri geçmeden 7 gün öncesine kadar her iki günde bir ortamı yenileyin.
- Kültürleri geçirmeden önce, plakaları/şişeleri oda sıcaklığında en az bir saat Matrigel ile kaplayın.
- Medyayı birleşen insan NPC kültürlerinden çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın, ardından PBS'yi aspire edin.
- Tüm kuyucukları kaplayacak kadar hücre ayırma solüsyonu ekleyin ve ardından 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Tüm hücrelerin ayrıldığından emin olun. Kuyucuklara / şişelere hücre ayırma çözeltisinin iki katı DMEM / F-12 (Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı / Besin Karışımı F-12) ekleyin.
- DMEM / F-12 içeren hücreleri 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve 5 ml insan NPC bakım ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri parçalamak için hücre süspansiyonunu nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Toplam hücrelerin üçte birini Matrigel kaplı kültür kuyucuklarına / şişelerine yerleştirin ve 10 μM Y-27632 ile takviye edilmiş yeterli ortamı doldurun. Kültür kaplarını 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Kültürleri her 3 ila 4 günde bir 1:3 oranında bölün ve her gün ortamı yenileyin. Farklılaşmayı önlemek için insan NPC kültürlerini yüksek yoğunlukta tutun.
>3. Ko-kültürlerde İnsan NPC'lerinin Nöronlara Farklılaşması
- Nöronlara farklılaşmayı başlatmadan önce lentiviral vektör Synapsin1-tdTomato'yu insan NPC kültürüne ekleyin. İnsan NPC'lerini ayırt etmeden önce astrosit/kortikal nöron ko-kültürlerini bir gün önceden hazırlayın.
- İnsan NPC kültürlerini 1x PBS ile bir kez yıkayın ve tüm kuyucukları/şişeleri kaplayacak kadar hücre ayırma solüsyonu ekleyin, ardından 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Tüm hücrelerin ayrıldığından emin olun. Kuyucuklara / şişelere hücre ayırma çözeltisinin iki katı kadar DMEM / F-12 ekleyin. 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 5 ml nöronal farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin. Hücre peletini tek hücrelere ayırmak için hücre süspansiyonunu nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Bir hemositometre ile tek hücrelerin sayısını sayın.
- Astrosit / kortikal nöron kültürlerinden ortamı dikkatlice aspire edin. Her 24 oyuklu için 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 500 μl nöronal farklılaşma ortamında 5 x 103 hücre/cm'de plaka insan NPC'leri. Astrositleri ve kortikal nöronları rahatsız etmemek için her bir kuyucuğa insan NPC'leri içeren ortamı nazikçe ekleyin.
- Plakaları 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin. Ortamın yarısını en az 28 gün boyunca her iki ila üç günde bir taze ortamla değiştirin.