DNA parmak izi Mycobacterium Suşlarının

Özet

Neden Lepra Mycobacterium, Birçok yerde hala endemiktir. Yayılması ve cüzam iletim modu hakkında bilgi edinmek için, bunu belirlemek için önemlidir suşu M. leprae Bir hasta enfekte. Değişken sayıda tandem tekrarlar (VNTR) yazarak, böyle bir yöntem.

Özet

Cüzam iletim çalışma etkeni bu yana, Mycobacterium leprae, laboratuvar ortamında kültüre edemez özellikle zordur . Bakteriler tek kaynakları cüzzam hastaları ve deneysel olarak enfekte armadillos ve çıplak farelerin. Böylece, modern epidemiyolojisi kullanılan yöntemlerden birçok cüzam çalışma mevcut değildir. Lepra için DSÖ ¹ tarafından uygulanan kapsamlı bir küresel uyuşturucu tedavi programına rağmen, cüzzam, yaklaşık 250.000 yeni vaka, her yıl pek çok ülkede endemik olarak ^kalır. 2 tüm M. leprae (mikro-ve minisatellites olarak da adlandırılır) genom ^3,4 eşlenen olmuştur ve birçok lokusların 2 veya daha fazla baz çiftinden segmentleri tekrarlanan olduğu tespit edilmiştir. M. ⁵ Klinik suşları leprae bu lokuslar birçok tandem tekrarlanan segmentlerinin sayısı (kısa tandem tekrarlar, STR) değişebilir. ^5,6,7 Değişken numarası tandem repeat (VNTR) ⁵ analizi, cüzzam basilinin farklı suşları ayırt etmek için kullanılır olmuştur . Lokusların bazıları diğerlerine göre daha istikrarlı, diğerleri aynı hasta, bazen daha hızlı bir şekilde değiştirmek gibi görünüyor ise, tekrar sayısı daha az varyasyon gösteren görünür. Belirli VNTRs değişkenliği gerginlik yazarak ^7,8,9 için uygunluğuna ilişkin sorular getirdi, ortaya çıkan veriler, istikrar içinde farklı birden fazla lokusların, analiz etmek, değerli bir epidemiyolojik araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Birden fazla lokus VNTR analizi (MLVA) ¹⁰ Çin ^11,12, Malavi ^8, Filipinler ^{10,13, 14} ve Brezilya da dahil olmak üzere birçok ülkede cüzzam evrim ve iletim incelemek için kullanılır olmuştur. MLVA birden fazla adım içerir. İlk olarak, bakteriyel DNA klinik biyopsilerin veya yarık cilt smear (SSS) konak doku DNA ile birlikte ayıklanır ¹⁰ istenilen lokusların sonra çıkarılan DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile güçlendirilir. 4-5 farklı lokusların için floresan etiketli primerler sonra istenen DNA segmentleri varlığını doğrulamak için ¹⁰ PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi tabi olabilir. Dört reaksiyon toplam 18 lokusların amplifiye olan, reaksiyon başına kullanılan ve kapiller elektroforez kullanarak floresan parçası uzunluğu analizi (FLA) için sunulmuştur. Armadillo gelen DNA pozitif bir kontrol olarak kullanılan her bir lokus için tekrar kopya sayısı ile bilinen bir bakteri geçişli. FLA kromatogramlar sonra Tepe Tarayıcı yazılımı ve parça uzunluğu VNTR kopya (alleli) sayısı dönüştürülür kullanılarak incelenmektedir. Son olarak, VNTR haplotipleri kalıpları için analiz edilir ve hastanın klinik veriler ile bir araya geldiğinde gerginlik türlerinin dağılımını izlemek için kullanılabilir.

Protokol

Bu video makalenin amacı, iş akışı, veri formatı ve sadece işin bu tip (Şekil 1) başlangıç ​​olabilir araştırmacılar için yorumlanması ile birlikte genel bir bakış sağlamaktır. Bu gösteri daha önce yayınlanmış eserleri anlatılan teknikleri, basitleştirilmiş protokolleri ve pratik ipuçları içerir. ^5,10

Genel İş Akışı ve Laboratuvar Hizmetleri:

Bu tür araştırma için en az 3 ayrı çalışma alanları bulunmalıdır. Laboratuvar PCR astar hazırlanması için kapağı (temiz hava kutusu veya izole edilmiş bir çalışma alanı) (dilüsyon, kısım hazırlama ve karıştırma), 2) kullanımı için ayrı bir biyo-güvenli kabine ve DNA ilavesi ile) bir ön-PCR alanda 1 olmalıdır PCR karışımlar, ve 3) bir post-PCR çalışma alanı jeller hazırlanması ve yükleme ve FLA için numune hazırlamak için. Astarlar ve DNA örnekleri ayrı dondurucu ve buzdolaplarında muhafaza edilmelidir. Primer kirlenme, bu tip laboratuvar çalışmaları şefi ve en kalıcı sorunların biridir. Astar ve PCR karışımları için kullanılan pipetler DNA için kullanılan olmaMAlıdır. Ön-PCR, PCR ve PCR sonrası çalışma alanları için ayrı bir pipet setleri olmamalıdır. Genellikle, bir araştırmacı, standart laboratuar ekipmanları kullanarak 12-24 saatlik süre içinde 12-18 örnekleri işleyebilir.

Işin her aşaması başlamadan önce:

• Bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin. Eldiven her zaman, biyolojik örnekler, astar, DNA ve etidyum bromür ele giyilmelidir. Eldivenler sık ​​sık değiştirin.
• PCR kabine davlumbaz, biyogüvenlik dolap ya da temiz bir çalışma alanı.
• Yeni bir tezgah kağıt veya ped kullanın.
• Sıvılar ve pipet uçları için uygun atık kapları ayarlayın.
• PCR kaput ve% 70 etanol ile pipetler içini silin.
• 15 dakika önce PCR UV ışığı Konu pipetler ve çalışma alanı kurdu. (Ultraviyole ışık çapraz bağları yüzey DNA kirleticiler.)
• Her zaman, DNA, astar ve PCR içeren malzemeler için aerosol önleme pipet uçları kullanın.
• Ele alarak aerosol kaçış ve çapraz bulaşmayı önlemek için açmadan önce herhangi bir boru / şeritler / sıvı içeren plakalarda santrifüjleyin.

1. M. leprae DNA hazırlığı

M. içeren klinik örnekler leprae deri klinikleri ziyaret lepra hastalardan elde edilir. Rutin tanı örnekleri deri punch biyopsi, yarık deride lekelenme veya burun bezlerden olabilir. Genellikle, temiz ve M. yeterli miktarda içerdiğinden punch biyopsi veya yarıklar cilt smear için en uygun moleküler epidemiyoloji leprae. Araştırma için bu malzemelerin kullanımı, kurumsal kurallarına göre onaylanmış olması gerekir.

1. 1 ml% 70 etanol ile vidalı kapaklı flakon cilt smear numuneleri biyopsi veya kesen koruyun.
2. 15 dakika boyunca 12.000 xg'de bir değişken hız tezgah üstü santrifüj her örnek santrifüjleyin.
3. Süpernatantı ve bir mikrosantrifüj tüp içinde yerleştirin. Gerekirse, bu numuneleri tekrar santrifüj yararlı olabilir ve daha sonra ek bir doku ya da DNA kurtarmak.
4. Fosfat ekle 500 ul doku örnekleri tamponlu salin (PBS) ve kalan etanol koruyucu döviz ve örnek rehidrate için 1 saat bekletin.
5. 20 dakika boyunca 12.000 xg'de bir tezgah üstü santrifüj örnekleri santrifüjleyin. PBS çözümü dezenfektan çözeltisi ile kısmen dolu bir çöp bidonuna atın.
6. Qiagen DNEasy öngörülen yönergeleri izleyerek Kan ve Doku kiti kullanılarak bakteriyel DNA ayıklayın.
7. Çıkarılan DNA 4 flakon içine aliquoted olmalıdır. Mağaza 2 alikotları -80 ° C ileride kullanmak için yeni teknolojilerin kullanıma hazır olduğunda, test sonuçlarının tekrarlanabilirliği gerekli veya eğer / ne zaman. Mağaza -20 ° C'de bir kısım ve 4 ° C daha acil kullanım için.
8. Bu doku örnekleri ile birlikte bir 'çıkarma boş' hazırlamak için ihtiyatlı olduğunu. Boş doku olmadan yapılır, ancak yukarıda belirtilen tüm tedavilere tabi tutulur. PCR hasta numuneleri ile birlikte ekstraksiyon boş operatörün çıkarma tekniği doğru olduğunu garanti etmek için ve bu reaktifler DNA kontaminasyonu.

2. Astar hazırlanması

1. En geniş gerilim tip veri vardır lokusların Astarlar Tablo 1'de listelenmiştir. Dört ya da 5 multipleks PCR primerleri birleştirilir. Her lokus Bir astar kapiler elektroforez parçası uzunluk analizi (FLA) sırasında tespit edilecektir 5 'floresan kimyasal etiketi taşır.
2. Her multipleks PCR kombinasyon için, her lokus için etiketli astar ve buna karşılık gelen ters astar ayrı Eppendorf tüpleri kombine bir tüp içinde ileri astar, başka bir ters. Stok astar, 100μM çözümleri (Şekil 2a) olarak hazırlanan bir kısmınıTE kullanarak 10 mcM bir konsantrasyon 10x seyreltilir (1x Tris-EDTA, pH 8.0). 100 mcM astar çözümleri Kalan alikotları daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de saklanır.
3. Eşit miktarda her 10 mcM astar her astar 2μM final konsantrasyonlarda karıştırılır. Astar kombinasyonları PCR karışımı (Tablo 3) eklendiğinde, her astar son konsantrasyonu 0.2 mcM düşer.

Kombine primerler PCR karışımlar (Tablo 3) eklendiğinde, son konsantrasyonları 0.2μM her bırakın.

3. Multipleks PCR kullanarak yükseltme bakteriyel DNA

1. PCR Kurulum
   • Kullanılacak örneklerin sayısını kaydedin ve gerekli plastik ve diğer malzemelerin toplanması gerekli reaktifler ve hacimleri ile önce bir çalışma sayfası hazırlar.
   • Steril tüpler / şeritler / örnek numaraları ile PCR için kullanılacak plakalar Etiket. Pozitif ve negatif kontroller eklemeyi unutmayın.
2. Bir temizlik solüsyonu (Decon ELIMINase gibi) ve program Tablo-2'ye göre PCR aşağı doğru silin. Temizlendikten sonra astar ve diğer reaktifler dokunmadan önce eldiven değiştirin .
3. Tablo 3 ve etiket kullanılmak üzere astar kombinasyonu ve örnek numaraları ile tüpler / şeritler PCR / plaka göre PCR Mastermix hazırlayın.
4. Her etiketli PCR örneklerinin tüp ya da iyi ile Mastermix kısım 18μl. Eldivenleri değiştirin.
5. Herhangi bir DNA kirleticiler çapraz bağ için 15 dakika UV ışık çalışma alanı ve pipetler tabi sonra, çalışma alanı ve araçlarını temizlemek ve dezenfekte yardımcı olmak üzere% 70 etanol ile ayrı bir biyo-güvenlik kabini ve pipetler aşağı doğru silin. Eldivenleri değiştirin.
6. Biyo-güvenli, temiz kabin, her PCR tüp / 20μl toplam hacmi (Şekil 2b) elde etmek için iyi plaka tüm sıvı malzemeler için aerosol önleme pipet uçları kullanın Mastermix DNA şablon 2μl eklemek.
7. Kısaca içeriği karıştırmak için PCR tüpleri / şeritler / plakaları santrifüjleyin.
8. Numune tüpleri / şeritler / plaka PCR ve PCR programını başlatmak.
9. Program tamamlandığında, 4 PCR ve mağaza ürünleri kaldırmak ° C elektroforez kadar.

4. PCR ürünlerinin jel elektroforezi

* Bu protokol, uzun yıllar boyunca standart edilmiş ve PCR ürünlerinin onayı FLA için onları göndermeden önce isteniyorsa, istihdam edilebilir bir isteğe bağlı bir adımdır .

1. Ayrı bir post-PCR çalışma alanında,% 2'lik agaroz jel hazırlayın. 1x TBE 2.0g agaroz powder/100ml (Tris / Borat / EDTA) bir cam şişe içinde tampon çözelti kullanın. Karışımı bir mikrodalga fırında yaklaşık 1.5-2 dakika için ısıtın. Swirl içeriği, agaroz çözmek için gerekirse tekrar ısıtma. Biraz serin ve örnekler için yeterli kuyuları ile bir tarak kullanarak bir form jeli dökün.
2. 4 - PCR ürünleri kaldırın ° C ve yaklaşık 30 saniye santrifüj.
3. 5x veya 6x jel yükleme tamponu (çeşitli şirketlerden Yükleniyor tampon kullanılabilir, ya da laboratuvar kadar karışık olabilir. Tarifler online olarak mevcuttur.) 0.5-1μl ile karıştırın PCR ürünü 2-5μl
4. 6μl örnek / yükleme tampon karışımı ile jel kuyu yükleyin. Moleküler bir merdiven, bir de (tercihen 20 bp merdiven) ekleyin.
5. Yaklaşık 90 dakika için 100V jel çalıştırın.
6. Sonra, bir zaman eşit miktarda ultra saf saf su içinde 15-30 dakika süreyle jel etidyum bromür çözüm etmesini sağlayınız.
7. Görüntü jel UV ışık uygulanır. (Şekil 3) 4-5 DNA segmentlerinin her kombinasyon için bir grup olmalıdır.
8. Jel kurumun tehlikeli madde politikasına uygun olarak imha ediniz. Etidyum bromür çözeltisi uygun bertaraf edilmeden önce birden fazla kez kullanılabilir.

5. Parça uzunluk analizi için hazırlanması örnekleri (FLA)

1. Temiz bir Eppendorf tüp, GeneScan -500 Liz boyutlandırma standart (Applied Biosystems) test edilecek her bir örnek için yeni bir kısım ve 0.3μl Hi-Di formamid çözüm 12μl içeren bir ana karışım hazırlayın. (Hi-Di formamid kimyasal ısıtma ihtiyacını ortadan kaldırarak, kapiller elektroforez DNA ipliklerini önce denatüre) kullanarak 96-optik kalitesi reaksiyon plaka, her formamid-Liz karışımı kısım 12.3μl iyi örnekler ve ayarlamak için kullanılan bir kenara plaka.
2. DNA örneği (Şekil 4a) her bir kuyu olduğu gösteren kayıtlar için bir tabak haritası olun.
3. Tüpler / şeritler ya da 96-plaka kullanarak, PCR kaliteli su PCR ürünün 1:60 seyreltme 59μl PCR ürün 1μl (Bölüm 3) ekleyin. Dilüsyonları jel bantların FLA veri veya parlaklık sinyal gücüne göre ayarlanır olabilir. DNA olabilir bile düşük konsantrasyonlarda(1:120 veya 1:180) yeterli olacaktır.
4. Formamid Liz karışımı içeren plaka de doğru seyreltilmiş PCR ürünü 1μl ekleyin.
5. PCR da 96 plaka yapıldı Hız ve verimlilik önemli ölçüde artabilir. Bir sade sırayla 3 tabak gibi hizaya: PCR ürünleri, PCR ürünleri seyreltme için steril su ile 2, Plaka ve Levha 3 formamid ve parça uzunluk analizi için boyutlandırma merdiven Levha 1. Bir çok kanallı pipet hızlı bir FLA hazırlık süreci için izin verir.

Genetik Analyzer ile Numune Analizi

6. Genetik Analyzer üreticinin talimat başına uygulanan flurophores algılamak için kalibre edin. Liz içeren bir boya seti kullandığınızdan emin olun.
7. Su kapları yıkayın ve odaları tampon EDTA (1x) (Applied Biosystems) ile yeni Tampon eklemek yenileyin.
8. Plaka için bir ön-yarık silikon septum ve tasarlanmış bir elinde tepsi tabak yerleştirin. Otosampler ileri götürmek Genetik Analyzer 'Tepsi' düğmesine basın. Otosampler üzerine tepsi ve Genetik Analyzer kapağını kapatın.
9. Analiz için bir elektronik tablo oluşturma veya içe aktarma. Alınabilir dosyaların uzantısı. Plt ve sekme ayrılmış biçimde. Dosyalar Excel (Microsoft) veya benzer programlar değiştirilebilir.
10. Örnekleri, 15 saniye için 1.6 kV bir enjeksiyon voltaj uygulayarak kılcal (50 cm uzunluk, POP-7 polimer) enjekte edilir Kapiller elektroforez, 1800 saniye boyunca 60 ° C'de 15 kV gerilim çalışır. Tüm süreç yaklaşık 45 dakika sürer.
11. Bir çalışma tamamlandıktan sonra, her bir numune analiz için veri. Fsa uzantıya sahip dosyaların içine dönüştürülür ve bir tabak dosya klasörü (Şekil 4b) yerleştirilir. Her veri dosyası yaklaşık 100 MB boyutunda bir flash sürücü üzerinde depolanan veya sıkıştırılmış ve e-postayla olabilir. Veri dosyaları gibi ABI GeneMapper veya Tepe Tarayıcı, uygun yazılım kullanılarak görülebilir.

6. Fragment length sonuçlarının analizi

1. Floresan kapiler elektroforez elde edilen verilerin analizi, özel bir yazılım gerektirir. Böyle bir yazılım mevcut değilse, Applied Biosystems web sitesine gitmek ve Tepe Tarayıcı indirmek. Yazılım ücretsiz ve oldukça iyi çalışıyor. https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603624
2. Açık Tepe Tarayıcı ve 'New Project' Add Files 'Başlat'. Pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere seçilir. Fsa veri dosyaları programa yükleyin.
3. Seçin (vurgulayın) ve tüm yüklü dosyaları "analiz". GS500 (-250) ve Analiz Yöntem:: Her bir örnek "Boyut Standart emin olun Boyutlandırma Standart-pp" Analyze ".
4. Renkli tepe örneklerinde DNA parçaları ile üretilen her baz çifti boyutunu inceleyin.
5. Baz çifti her pik boyutu değeri kaydedin ve pozitif kontrol zirvesine karşılaştırın.
6. Pozitif kontrol örneklerinde Peaks baz çifti ve 4-7 Tablolarda listelenen tandem tekrarlar numaralarını numaraları ile olumlu karşılaştırmak gerekir.
7. Pozitif kontrol ile karşılaştırıldığında, her bir örnek allel mevcut kaç kısa tandem repeat kesimleri belirleyin. Biz incelenmektedir her lokus VNTR kopya sayısı için sıralı olmuştur NHDP63 kullanın. ⁴
8. Karşılaştırmalı ve / veya matematiksel analiz için bir elektronik tabloya kaydedilen veriler girin. VNTR 'parmak izi' ya da haplotipleri, M. karakteristik allellerin tanımlanan lokusların dizeleri leprae süzün.

7. Temsilcisi Sonuçlar

PCR ürünlerinin jel elektroforezi umarım astar kombinasyonu her odağı için bir grup (Şekil 3) üretecek. Şekil 3'te, jel 2 bölüm vardır: üst kısmında 1 PCR örnekler ve alt kısmında Kombinasyon 2 örnekleri Kombinasyon. Her bölüm 8 hasta numunelerinin elde edilen PCR ürünleri takip eden bir 20 baz çifti moleküler merdiveni, içerir. Kombinasyon 1 de negatif kontrol ve nihayet bir pozitif kontrol (NHDP63 suşu) vardır. (2 kombinasyonu kontrolleri farklı bir jel üzerinde idi.) En örnekleri açıkça kombinasyonu her lokus için 5 bantları, 1 ekran unutmayın. Bazı durumlarda, bantları da sadece 4 bant görünümü ile sonuçlanan ayrı lokusların olarak görünür birbirine çok yakın olabilir.

Beklenen Amplikon boyutları Tablo 1'de listelenmiştir. Laboratuvarımız M. NHDP63 gerginlik kullanır Pozitif kontrol olarak leprae. İki tür tekrar segmentleri incelenmiştir: mikrosatellit lokus'u (1-5 tabanı tekrarlar) ve minisatellite lokusların (5 baz çifti birden çok kez tekrarlanan daha büyük kesimleri ile).

Kapiler elektroforez veri dosyalarını yorumlanması 2 standartlarına dayanıyor: dahili bir DNA parçası boyutlandırma standart GeneScan-500LIZ (ABI) ve bakteriyel DNA amplifiye harici bir pozitif kontrol örneği olarak nitelendirdi.

FLA kromatogramların, Tepe Tarayıcı yazılımı kullanılarak izlenebilir, Şekil 5a, 5b ve 6 olabilir.

Tepe Tarayıcı Amplikon boyutuna veri (x-ekseni baz çifti) ve sinyal gücü (y-ekseni) sağlar. Büyüklüğü ve pik yükseklik değerleri en önemli olmasına rağmen (Şekil 5b) pik alanı, vb. Ek veriler de mevcuttur. Yüksekliği 100 birim daha az Peaks genellikle güvenilir olması çok zayıf bir sinyal olarak kabul edilir.

Şekil 6 lokus (GTA) 9 tandem tekrarlar sayısı bir varyasyon gösteren, pozitif kontrol (NHDP63) ve iki hasta numunelerinin karşılaştırır. Pozitif kontrol olarak, sırası (GTA) 10 kez tekrarlanır. NHDP63 VNTR ve Amplikon boyutu, gen sıralama ile doğrulandı. Hasta 4 PCR Amplikon 3 bp Hasta 6 3 bp 11 tekrarlar (GTA) ifşa NHDP63 daha büyük bir Amplikon iken, sadece 9 tekrarlamak birim vardır gösteren pozitif kontrol daha küçüktür. Hasta 2, bu nedenle çok az veya hiç DNA PCR çoğaltma, hiçbir FLA sinyali düşük bakteriyel indeksi (BI) vardı.

FLA veri yorumlama güçlüğü bazen 'kekemelik' bir sonucu olarak ortaya çıkar. PCR reaksiyonu sırasında, DNA polimeraz kaynak aleli daha uzun veya kısa, 1 ya da daha fazla tekrarlar parçaları üretebilir. Bunlar genellikle ana tepe çevreleyen alt yüksekliği zirveleri olarak kabul edilmektedir. Onlar, daha büyük veya daha küçük temel tepe tekrar segment baz çifti sayısını doğru olduğunu 'merdiven' olacak. Sonucu aynı renk zirvelerinden bir ailedir. Şekil 7 lokus (TA) 10 ile bunu göstermektedir.

Bazen FLA karşılaşılan bir diğer zorluk içerir '+ A' ya da 'A-atık' DNA polimeraz [genelde adenin (A)] kopyalanan DNA segmentinin 3 'sonuna kadar tek bir baz ekler. Bu, Şekil 8'de gösterildiği gibi komşu zirve göre 1 baz çifti büyük bir ana ya da kekeme bir tepe sağ bir zirve olarak FLA gösterir. Bir ana ya da kekeme bir zirve ile karıştırılmamalıdır. Bir ana tepe ve onun bir kuyruklu tek bir tür olarak kabul edilir. A-kuyruk VNTR tekrarlarının sayısını değiştirmez. (Bazı DNA polimeraz kitleri özellikle bu karıştırıcı etkisini azaltmak için A-atık teşvik etmek için tasarlanmıştır. A-atık tam teşvik etmek yerine tek bir pik zirvelerinden bir çift üretmek eğilimindedir.)

DNA ekstraksiyonu ve PCR ürünlerinin M. hem de içerir . leprae ve insan DNA (TA) 18 istisna, ancak, primerler sadece bakteriyel DNA yükseltmek kadar özel, çok az veya hiçbir insan DNA amplifikasyonu var. (TA) 18 sık sık insan DNA ve armadillo geçişli DNA örnekleri (Şekil 9) görmedim 242 baz çifti bir tepe oluşturur.

Primer raf ömrü genellikle iyi -20 ° C, sadece acil kullanım için kaldırıldı tutulur ve sonra tüketilen ° C ye kadar 4 saklanır. Astarlar, 4 ° C'de 1-2 hafta sabit olmalıdır. PCR için primer kombinasyonlar yapma biraz zaman alıcı olsa da, sadece acil kullanım için yeterli astar kombinasyon hazırlanmış olması tavsiye edilir. Primer kombinasyonlarının uzun süre saklandığı zaman biraz düşmeye görünüyor.

TE büyük stoklar aliquoted ve alikotları ya dondurulmuş ya da oda sıcaklığında saklanabilir. 200-400μl Büyük alikotları kurutulmuş veya konsantre astar stokları (Şekil 2a) seyreltilmesi için iyi. 10-50 ul küçük alikotları astar kombinasyonları 3 ve 4 hacimleri tamamlayan için yararlıdır. TE ucuz ve alikotları kullanımdan sonra atılmalıdır.

Multiplex enzim kitleri oldukça pahalıdır ve kullanana kadar dondurulmuş (-20 ° C) muhafaza edilmelidir. PCR hazırlık kullanılmayan multipleks çözümleri 4 hemen iade edilmelidir ° C Küçük Qiagen Multiplex PCR Kit multipleks karışımı, her çözüm içeren 0.85ml (850μl) 3 tüpleri ile birlikte gelir; yeteri kadar yaklaşık 65-70 PCR.

Genellikle, DNA örnekleri, astar ve multiplex kiti çözümleri de dahil olmak üzere laboratuvar çalışmaları bu tür kullanılan malzemeler için tekrarlanır, büyük sıcaklık değişimleri önlemek için en iyisidir. Kadar gerekli tüm malzemeler -20 ° C'de saklanır ve daha sonra 4 tüketilen ° C kadar muhafaza edilmelidir. DNA Uzun süreli depolama -80 ° C olmalıdır

Harcanan doku, astar ve / veya DNA içeren tüm materyaller otoklavlanabilir ve bertaraf edilmelidir herhangi bir kullanımı artık. Tüm numuneler tedaviethidium bromür veya formamid tehlikeli atık olarak muamele ve kurumun tehlikeli madde politikasına uygun olarak bertaraf ile.

Tablo 1: suşu NHDP63 Amplikon boyutları

Tablo 2: VNTR PCR için Parametreler Bisiklete binme

Tablo 3: PCR hazırlanması

Tablo 4: Kombinasyon 1 Allel Aramalar

Tablo 5: Kombinasyon 2 Allel Aramalar

Tablo 6: Kombinasyon 3 Allel Aramalar

Tablo 7: Kombinasyon 4 Allel Aramalar

Şekil 1: VNTR-FLA Süreç Akış Şeması

Şekil 2. Kombinasyon 1 Üst Astarlar (a) Hazırlık (Eppendorf tüp resim nezaket www.clker.com ). (B) PCR Kurulum (8 PCR için) (www.clker.com Eppendorf tüp resim nezaket)

Şekil 3. Birleşmeleri 1 ve 2 VNTR PCR ürününün DNA agaroz jel

Şekil 4. (A) FLA Levha Haritası (b) FLA veri dosyaları: *. fsa

Şekil 5. Kombinasyon 1 VNTR lokusların Pozitif Kontrol (a) FLA Kromatogram (NHDP63) (b) Amplikon boyut ve bolluk Tepe Tarayıcı (GTA) 9

Şekil 6 lokus (GTA) 9 PC (NHDP63) PCR örneklerinin karşılaştırılması

Şekil 7 (TA) 10 Ana ve Stutter Tepeler

Şekil 8: + Ana veya Stutter Peaks Komşu A (A-kuyruk) Peaks.

Şekil 9: (TA) 18 Ana Peak, Stutter Peaks ve İnsan DNA Tepe

Şekil 10: M. leprae VNTR verilere göre M. (A) Gerinim Farklılaşma (B) Gerinim Farklılaşma leprae MLVA DNA Parmak İzi

Tartışma

Lepra hastalardan alınan deri örneklerinin toplanması cilt kliniklerinde çalışan yetenekli klinisyenler veya teknisyenler gerektirir. Bu örnekleri ele Laboratuar çalışanları, laboratuvar mont, eldiven ve koruyucu gözlük takın ve enfekte insan veya armadillo doku örnekleri ele alırken bir biyo-güvenlik kabini içinde çalışmak çok dikkat etmelidir. Dezenfeksiyon yüzeyler ve araçları da önemlidir. DNA örnekleri kirlenmesini önlemek için temiz, steril bir biyo-güvenli kabine çalışmak önemlidir.

DNA ekstraksiyonu Qiagen gibi şirketlerden ekstraksiyon kitleri geliştirme sayesinde nispeten kolay hale gelmiştir. Yol dikkatle takip edilmelidir. Kullanılmadığı zaman Tüm numuneler soğuk tutulmalıdır. Örnekleri için tekrarlanan, aşırı sıcaklık değişimleri kaçının.

Bu çalışmada kullanılan DNA primerleri Bu yazının sonunda literatür referansları listesinde atıf almıştır çeşitli şirketlerden sipariş edilebilir. Kontaminasyonu önlemek için primerler ile DNA özgür bir ortamda çalışması için önlemler alınmalıdır. Astarlar kuru toz olarak gelir ve TE ile karıştırılır ve bir 100μM konsantrasyona seyreltilmelidir, sonra da küçük miktarlarda (Şekil 2a) ayrılır . Astar Çalışma çözümleri 10μM konsantrasyonları daha seyreltilir. Yine, alanları / primerler kullanılır ve hazırlanan davlumbaz DNA örnekleri kullanmayın.

PCR ürünleri kullanılmadığı zaman da soğuk muhafaza edilmelidir.

% 3 agaroz jel hazırlanması daha iyi DNA bant ayrımı vermek, ama çalıştırmak için uzun sürer. Tamamen niteliksel amaçlar için,% 2 genellikle yeterlidir. Agaroz jel DNA boyama için kullanılan etidyum bromür çözüm son derece aktif genotoxin deri yoluyla emilir. Bu çözüm ve büyük bir özenle ve eldiven giymek için her zaman emin olmak boyanmış jeller taşıyınız. Herhangi bir DNA numune veya etidyum bromür malzemeleri dokunduktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Etidyum bromür boyama çözüm atın, kurumsal kurallarına göre yıkama ve jeller. Jeller rutin olarak gerekli değildir; FLA yöntemleri kurulduktan sonra bu adımı ortadan kaldırılabilir. Zaman ve reaktif alıcıdır.

FLA için numune hazırlamada kullanılan formamid çözüm de son derece toksik ve dikkatle ele alınmalıdır. Kendi kullanımdan sonra ellerinizi yıkayınız. Kurumsal yönergeleri izleyerek atın.

Tepe Tarayıcı yazılımı kullanarak FLA sonuçları okunması zor olabilir. Allel aramaları (tandem tekrarlar sayısı) bir temel set CSU (Tablo 4-7) geliştirilmiştir. (M. diğer suşları leprae çalışılmaktadır 4-7 Tablolar herşey dahil olmayabilir dikkat edilmelidir. Listelenen aralıkları dışında kopya sayıları ile allel olabilir.) Bir nevi meydan okumadır 'kekeme' doruklarına içerir. Bu aileler, özellikle sadece böyle 10 (TA) 2-3 baz çifti tekrarlar içeren Şüpheli İşlem zirvelerinden. Bazen okumak için doğru tepe seçmek zordur (Şekil 7). Bu şekilde, 190 bp pozitif kontrol tepe ana zirve. 2 yüksekliği düşük Peaks, 4, hatta 6 baz çiftinden daha büyük veya daha küçük ana zirve 'kekeme doruklarına.' Denir A-atık da karışıklığa neden olabilir. A-atık önceki metin ve Şekil 8'de açıklanmıştır. Son olarak, PCR ürünlerinin örnekleri oldukça bol, zirveleri çift sivri görünebilir. Bu durumda, tepe formu merkezi okuyun. (Bkz: Şekil 6, Hasta 6 )

Veri yönetimi, bu tür çalışma için zorlu bir görev olabilir. Bir görev ya da işlem tarihinden, operatör, şerit / plaka haritalar, FLA siparişleri, PCR koşulları ve yemek tarifleri, jeller ve fotoğraflar tarihleri, depolama sıcaklıkları, DNA örneğinin dilüsyonları, FLA: tüm ilgili gibi tüm deneyler için bilgi kaydetmek için önemlidir. elektronik dosya depolama yerleri, vb İyi organizasyon ve veri yönetimi, gelecekte belirli bilgi parçaları için harcanan zaman saatlerce kaydedebilirsiniz.

Burada açıklanan laboratuar çalışması, Colorado State Üniversitesi ve dünyadaki diğer yerlerde birkaç yıldır devam etmektedir. Toplanan verilerin her türlü vasıta ve ileride kullanmak nasıl olabilir ne büyük resim ortaya çıkmaya başlıyor. Şekiller 10A ve 10B bu DNA parmak izi farklı M. ayırt etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek ülkelerde (10A) ve hatta arasında aile (10B) leprae suşları arasında. Aile ve toplum bağlantılı durumlarda M. taşımak için gösterilmiştir. leprae benzer veya aynı VNTR zorlanma türleri. Umut iletim şebekeleri erken bir algılama sistemi, bu insanlar ecek için geliştirilmiş olabilir cüzam iletim modu (ler) böylece daha fazla fikir edinmek mümkün olabilir.t risk ve tedavi edici ilaç tedavisi, kalıcı nörolojik ve dermatolojik hasar yapılmadan önce başlayabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DNeasy Kan ve Doku Seti	Qiagen	69504
Multiplex PCR seti	Qiagen	206143
DNA Astarlar	Çeşitli
Agaroz Jel	Çeşitli
5x veya 6x Jel Yükleniyor Tampon	New England Biolabs	B7021S	Kendi * yapmak için kullanılabilir Tarifler
Ethidium Bromür çözümü	Çeşitli		Con ile seyreltilir.
Hi-Di Formamide Çözüm	Applied Biosystems	4311320
Gene Tarama -500 Liz	Applied Biosystems	4322682

Ekipman	Yorumlar
2 Buzdolapları	4 ° C: DNA örnekleri için 1, 1, astar ve Multiplex reaktifler
1 adet mikrodalga fırın	Agaroz ve su jeller yapmak için ısıtma veya uygun bir şekilde
1 otoklav	Malzemelerin sterilizasyon veya düdüklü tencere
PCR makinesi	PCR
2 takım pipet	0.5-10 ul, 10-100 ul, 20-200 ul, astarlar için 1000 ul 1 set, 1 set DNA
Denizaltı jel elektroforezi kutusu	Formlar hazırlanması jeller ve taraklar.
Elektroforez Güç kaynağı	Jel kutusu bağlantı kabloları ile
Isı blok	Eppendorf tüpleri için
Santrifüj	Eppendorf tüpleri / şeritler için
Kapiler elektroforez sistemi (genetik analizör)	Veya bu analiz, bir kurumun erişim
Plastik	Tek kullanımlık aerosol pipet uçları, Eppendorf tüpleri, 8-iyi şeritler, 96-iyi plakaları, optik kalitesi
İnternet bağlantısı olan bilgisayar