Ayrı ayrı seçmek işlemek için bir yöntem tarif ve görüntü canlı patojenlerin dönen bir diskin mikroskop optik bir tuzak kullanıyor. Optik tuzak mekansal ve zamansal organizmaların kontrolü sağlar ve konak hücrelerine onları komşu yerleştirir. Floresan mikroskopi hücrelere az pertürbasyon dinamik hücrelerarası etkileşimleri yakalar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak
Bu makalede
Özet
Özet
Dinamik canlı hücre görüntüleme, bağışıklık sistemi 1, 2 hücreleri arasında gerçek zamanlı etkileşim doğrudan görselleştirme sağlar; Ancak, fagositik hücre ve mikrop arasındaki mekansal ve zamansal kontrol eksikliği patojenlere karşı konak yanıtının ilk etkileşimler içine gözlemler odaklı hale getirdi zordur. Tarihsel olarak, hücrelerarası kişi olaylarının fagositoz 3 gibi iki hücre tipleri karıştırma imaged ve sonra sürekli etkileşim uygun aşamada serendipitous hücrelerarası kişileri bulmak için tarama alan görünümü. Bu olayların stokastik bu sürecin doğa sıkıcı işler ve bu yaklaşım, erken ya da hücre-hücre teması kısacık olaylar gözlemlemek zordur. Bu yöntemi, temas eşiğinde hücre çiftleri bulma ve onlar erdirmek onların iletişim kadar onları gözlemleyerek gerektirir, ya da yoktur. Bu sınırlamaları aşması için, hücre kültürü yerleştirmek için bir non-invaziv, yıkıcı olmayan, ancak hızlı ve etkili bir yöntem olarak optik yakalama kullanın.
Optik tuzaklar, ya da optik cımbız, giderek, hücre ve diğer mikron boyutlu parçacıklar üç boyutlu 4 yakalama ve fiziksel olarak manipüle biyolojik araştırmalarda kullanılmaktadır. Radyasyon basıncı ilk gözlenen ve 1970 5, 6, optik cımbız sistemleri uygulanan ve ilk kez 1987 7 biyolojik örneklerin kontrol etmek için kullanılmıştır. O zamandan beri, çeşitli biyolojik olgunun 8-13 prob optik cımbız bir teknoloji haline gelmişti.
Biz gelişmeler, optik bir tuzak olarak belirlenen ana hücreleri ile etkileşimleri kolaylaştırmak için fizyolojik bir ortamda patojen organizmaların nefis mekansal ve zamansal kontrol sağlamak için sıcaklık ve nem kontrolü ile disk konfokal mikroskopi iplik ile entegre ederek hücre görüntüleme canlı bir yöntem 14 tarif operatörü. Canlı, immün sistemi baskılanmış bireyler 15, 16 (örneğin AIDS, kemoterapi, ve organ nakli), potansiyel olarak ölümcül, invaziv enfeksiyonlara neden Candida albicans ve Aspergillus, patojen organizmalar gibi optik bitişik tahribatsız lazer yoğunlukları kullanılarak yakalanmış ve taşındı makrofajlar, patojen fagosite. Yüksek çözünürlük, ışık ve floresan tabanlı filmler iletilen canlı hücreler fagositoz erken olayları gözlemleme yeteneği kurulmuştur. Immünoloji geniş uygulanabilirliğini göstermek için, birincil T-hücrelerinin sıkışıp kalmasına ve in vivo anti-CD3 kaplı mikrosferler ile sinaps oluşturmak için manipüle ve sinaps oluşumu zaman atlamalı görüntü de elde edildi. Canlı patojenlerin bağışıklık sistemi hücrelerine göre ince mekansal kontrolü uygulamak için bir yöntem sağlayarak, hücresel etkileşimler hücrelere az pertürbasyon floresan mikroskobu ile yakalanan ve güçlü bir anlayış doğal ve adaptif bağışıklık erken cevaplar verebilmesidir.
Protokol
1. Kültür koşulları optik yakalama patojenlerin
- 3 gün boyunca 30 SBD (Sabouraud dekstroz) içeren yarı-katı agar medya ° C A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) büyütün.
- C. büyütün 30 gece bir çalkalayıcı inkübatör 100 mg / ml ampisilin içeren YPD albicans (SC5314) (Maya Peptonlu Dekstroz) sıvı kültür ° C
2. Floresan etiketlenmesi için patojenlerin hazırlanması
- Hasat patojenlerin miktarı istenen ve 1.5 ml reaksiyon tüpüne transfer.
- Fosfat ekle 300 mcL reaksiyon tüpü tamponlu salin (PBS).
- 30 saniye boyunca karışımı sonikasyon.
- 4000 rpm'de 1 dakika boyunca....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
- 5 mikron Bu çalışmada, 3 mikron arasında boyutları ile patojenler yakalamak için optik bir tuzak. Laboratuara ilgi patojenler genellikle bu boyutları olsa da, burada açıklanan optik cımbız sistemi, boyutları çok geniş bir yelpazede yakalamak için esnek. Aslında optik tuzakları tek atomdan hücreleri çapı yaklaşık 10 mikron arasında değişen partiküller yakalamak için kullanılmıştır. Küresel, eliptik ve biyolojik patojenler ile çalışırken yararlı çok uzamış parçacıklar: Ayrıca, bu optik yakalama sistemi çeşitli şekillerd.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma Tıp İç Fonları Massachusetts Genel Hastanesi Bölümü (JMT, MKM, MLC, JMV) Ulusal Biyomedikal Görüntüleme Enstitüsü ve Biyomühendislik hibe T32EB006348 (MSK), Massachusetts Genel Hastanesi Kullanıcı Hesaplamalı ve Bütünleştirici Biyoloji geliştirme fonu için Merkezi ve AI062773 (tarafından desteklenen oldu RJH), hibe AI062773, DK83756 ve DK 043.351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID) (NIH) AI057999 (JMV .) Nicholas C. Yoder teknik yardım için yararlı tartışmalar için teşekkür eder, ve Charles Keçeler (RPI, Inc.)
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifin Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| A. fumigatus | Albino zorlanma, B-5233/RGD12-8, KJ Kwon-Chung, NIH hediye | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, Eleftherios Mylonakis, MGH hediye SC5314 zorlanma, Gerald Fink hediye, Whitehead Enstitüsü'nden | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimetilformamid | Sigma | D4551 | |
| Taze kan | MGH, HMS RJW Heath, hediyelik | ||
| Nikon inverted mikroskop | Nikon | Model Ti-E | |
| Yakalama lazer, ChromaLase | Blue Sky Araştırma | CLA-106-STF02-02 | |
| Floresan uyarma lazer | Tutarlı | Model Innova 70C | |
| Yakalama bileşenleri için Breadboards | Thorlabs | MB1224, MB1218 | |
| Optik hava tablo | Teknik Manufacturing Corporation | ||
| Pedal kontrolü Elektronik shutter | Uniblitz | Vincent Associates, Rochester, NY satın | |
| Singlemode fiber optik | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber pozisyoner | Thorlabs | PAF-X-5-C | |
| Fiber kolimatör | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Teleskop için objektifler | Thorlabs | AC254-150-B | Odak uzaklığı 150 mm |
| Çeviri aşamaları (x, y, z) | Newport | M-461-XYZ | |
| IR dikroik ayna | Renk parlaklığı | ET750-sp-2p8 | |
| Objektif lens (100X) | Nikon | NA = 1.49, immersiyon yağı, TIRF hedefi | |
| Konfokal kafa | Yokogawa | CSU-XI | |
| Kutuplaştırıcı | Nikon | MEN51941 | |
| Wollaston prizma | Nikon | MBH76190 | |
| EM-CCD kamera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| CCD kamera (ORCA ER) | Hamamatsu | C4742-80-12AG | |
| Filtre tekerlek | Ludl | 99A353 | |
| Filtre tekerlek | Sutter | LB10-Nwe | |
| Odacıklı coverglass | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Anti-CD3 ile kaplı |
| Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM) | Invitrogen / Gibco | 10313 | |
| Penisilin / streptomisin | Invitrogen / Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamin | Invitrogen / Gibco | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
Kaynaklar
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
