Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Subkutan Muskarinik Antagonistleri Yönetim ve Farelerde levator Auris longus'un Triple-immün

13.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/3124

⸱

8 Eylül 2011

 ,  , 
1Biology Department, Arcadia University, 2Shriners Hospitals Pediatric Research Center, Temple University School of Medicine, 3Shriners Hospitals Pediatric Research Center and Department of Anatomy and Cell Biology, Temple University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Levator auris longus (LAL) genç erişkin farelerin kas muskarinik sinyalizasyon inhibitörleri tekrarlanan yönetim ve wholemounts nöromüsküler kavşak sonraki immün (NMJs) için prosedürleri açıklar. LAL kas ifşa ettiği için benzersiz avantajları vardır. In vivo NMJs farmakolojik etkileri.

Özet

Gastroknemius ve tibialis anterior gibi kemirgenler, Hind bacak kasları memeli NMJs oluşumu ve korunması için gerekli sinyalleri in vivo farmakolojik çalışmalarda sık sık kullanılır . Ancak, subkutan veya intramusküler uygulamadan sonra bu kasların içine ilaç penetrasyonu genellikle eksik ya da düzensiz ve birçok NMJs etkilenmez. Mini pompaları gibi cihazlar ile sistemik yönetim Spatiotemporal etkilerini artırabilir olsa da, bu yaklaşımın invaziv doğası karıştırıcı inflamatuvar yanıtları ve / veya doğrudan kas hasarına neden olabilir. Ayrıca, zaman alıcı bir seri kesit ve kapsamlı immün gerektirdiğinden bir arka bacak kas NMJs tam analizi zordur.

Fare LAL boyun dorsum yüzeysel olarak bulunan ince bir kas, düz levha. Bu, hızlı kasılan kas fonksiyonları kulak kepçesi taşımak için. Kafatası orta hat kaynaklanan ve her kepçesi kıkırdak kısmının yanal uzatmak rostral ve kaudal kısımları içerir. Kas çıkar Stylomastoid foramen olarak kaudal projeler yüz sinirinin bir şube tarafından verilir. Biz ve diğerleri, hem de kısa ve uzun vadeli NMJs ve kasları ilaçların in vivo etkilerinin araştırılması için avantaj sunan uygun bir hazırlık olması amacıyla LAL bulduk . İlk olarak, yüzeysel bir konumda, hafif anestezi altında ilaçlar birden fazla yerel uygulamaları kolaylaştırır. İkincisi, inceliği (2-3 kat kas liflerinin), kas içinde hemen hemen tüm NMJs görselleştirme ve analiz izin verir. Üçüncü olarak, onun innervasyon deseni ile birlikte sinir bozulmadan diseksiyon kolaylığı, ek elektrofizyolojik analizi, in vitro 9,5 izin verir. Belki de son ve en önemlisi, uygulanan küçük bir hacim (~ 50μl) kolayca tüm kas yüzeyi kapsayan tüm NMJs ilaç düzgün ve uzun süreli maruz kalma sağlar ve sistemik bir yaklaşım 1,8 ihtiyacını ortadan kaldırır .

Protokol

1. Muskarinik asetilkolin reseptör (mAChR) antagonistleri subkutan uygulanması

  1. 1.5mL reaksiyon tüp içinde steril serum fizyolojik uyuşturucu eriterek mAChR antagonisti aseptik koşullarda, uygun doz, (bkz. Tablo) altında hazırlayın. Aşağıdaki antagonistleri kullanıldı: atropin, Methoctramine, 4-DAMP AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
  2. A1cc insülin enjektörü çözüm 50μl çizin ve her bir fare için ayrı bir şırınga kullanın. Ayrıca, sadece kontrol grubunda her fare için serum fizyolojik içeren şırınga hazırlar. Enjekte etmek için hazır olana kadar buz üzerinde şırınga tutun.
  3. Uygun anestezi derinliği tutam ayak yanıt eksikliği gözlemleyerek, ketamin ksilizin kokteyl (120 mg / kg ketamin, 8 mg / kg xylazine) fareler anestezi.
  4. Uygun sedasyon sonra, boyun kaudal bölge başkanı rostral bölgeyi kapsayan saç tıraş,% 70 etanol ile uzak kalan saç silin.
  5. Place stereomicroscope altında fare ve şırınga, iğne (Şekil 1A, B) hafifçe yukarı çekerken LAL kas iğne paralel eklemek. Bu bağ dokusu üzerinde iğne sokulur ve LAL kas kendisi doğrudan zarar vermez sağlar. Iğne ucu LAL kas kaudal yönünü kapsayacak şekilde yerleştirin.
  6. Çok yavaş şırınga geri çekilirken doğru LAL kas üzerinde çözüm enjekte etmeye başlar; toplam enjeksiyon süresi yaklaşık 1 dakika olmalıdır. Düzgün bir şekilde enjekte edilirse, çözüm örten deride en az bir saat kalacak, yaklaşık 1 cm çapında bir "dome" oluşturmalıdır. Düzgün enjekte çözüm sağ LAL kas tüm rostral ve kaudal bölgeleri kapsayacaktır.
  7. 1 ila 7 gün boyunca her 12 saatte bir aynı işlemi tekrarlayın. Diğer studies1 için, büyüme faktörleri, her 12 saatte bir 21 gün kadar enjekte etmek için aynı protokol kullanılır. 21 güne kadar, anestezi 2x bir gün ile uygulanan farelerde anormal tepkiler gözlendi.

2. LAL kaslarının diseksiyonu

  1. Pentobarbital sodyum aşırı dozda (390 mg / kg) ile fareler Euthanize. Ölüm torakotomi sonra kalp atışı eksikliği değerlendirerek güvence altına alınmıştır.
  2. 1 pin ve burundan 1 pin her pençe, bir diseksiyon çanak dorsal tarafına fareyi yukarı aşağı pin.
  3. Sol, sol kürek kemiği çevresinde bölgeye kulak sadece proksimal bölgeden LAL birlikte kesmek için küçük yaylı makas kullanılarak, sadece deri yoluyla ilk kesi olun.
  4. Bu bölgede cilt dikkatlice çıkarın, ama bu doğru LAL kas ek puan olarak sağ kulak çok yakın kesme önlemek.
  5. Başın yüzeysel yüzeyinde orta hat boyunca sağ ve sol LAL kasları karşılayan lipid merkezi bir konuma sahip yağ dokusu şeridi, bulun. Küçük yaylı makas kullanılarak, omuz (Şekil 1C) ulaşana kadar sağ sol LAL kas proksimal kenarından yağ dokusu (sol kulak doğru) 1cm kesti.
  6. Bir kez kesi, geriye doğru LAL kas kas ventral tarafında ortaya çıkarmak için küçük forseps ile soyma yapılır. Forseps (Şekil 1C) ile sağ LAL kas dikkatle yukarı çekerken, bağ dokusu ve fasya kesin.
  7. Kulağının dibinde kaudal sonuna doğru LAL etrafında kesin. , Kesim, sağ kulak rostral sonuna doğru hareket, sağ LAL (Şekil 1C) devredildi tutarak devam edin . LAL kendisi zarar riski daha bu aşamada daha fazla doku dahil etmek daha iyidir. Kas, pipet 1X PBS kas üzerinde kurumaya başlar.
  8. Place 1X PBS, dorsal tarafına içeren 30mm kültür Sylgard çanak LAL disseke. Küçük böcek iğneli kas dört köşe aşağı pin.
  9. Sağ LAL kas dorsal ve ventral yüzeyleri küçük forseps ve yaylı makas, temiz, bağ dokusu kullanma. Ventral yüzeyi temizlemek için kas ters çevirin ve yeniden-pin. 2-3 kaslar aynı 30mm çanak yerleştirilmiş olabilir.

3. LAL NMJs Triple immün: 1. Gün

  1. Başında immün önce, gerekli tüm reaktifler hazırlamak. 1X PBS,% 2 sığır serum albumin BSA) / PBS,% 2 0.1M Glycine BSA / PBS,% 2 BSA / PBS, ve% 4 1X PBS paraformaldehid (PFA)% 0.2 Triton X100 ihtiyaç duyulacaktır. -20 ° C derin dondurucuda Pre-soğuk metanol.
  2. Bu işlem sırasında çanak dorsal tarafına tutturulmuş LAL kasları bırakın. 1X PBS çözümü atın ve kas karşılamak için yeterli% 4 (PFA) ekleyebilirsiniz. Çalkalayıcı yerleştirin çanak 20 dakika boyunca 2 veya 3 hız ayarlayın. Aksi belirtilmedikçe, aşağıdaki adımları çanak çalkalayıcı üzerinde yer olmalıdır.
  3. % 4 PFA atın kas ve 1X PBS 3 kez, 10 ', her ile yıkayın.
  4. Son 1X PBS 2% 30 'BSA / PBS çözüm 0.1M Glycine yıkayın ve eklemek atın.
  5. 0.1M Glycine çözümü bir atınd eklemek 1X PBS 1:200 15 'lik bir konsantrasyon rodamin konjuge α-bungarotoxin içeren.
  6. Α-bungarotoxin çözüm atın ve 1X PBS, 3 kez 10 'her kas yıkayın.
  7. Ön soğutmalı metanol ekleyerek doku Permeabilize ve tam 5 dakika boyunca -20 ° C derin dondurucuda çanak, hiçbir ihtiyaç sallayarak.
  8. Metanol çıkarın ve 3 kez 10 'her 1X PBS ile yıkayın. Ile son yıkama ve blok doku atın% 0.2 triton X-100,% 2 BSA / PBS 1 saat. Yıkama ve engelleme adımları oda sıcaklığında yapılır.
  9. 4, titreme, gecede kasları inkübe ° C primer antikorları bloke çözüm (bkz. Tablo) seyreltilmiş bir kokteyl.

4. LAL NMJs Triple immün: 2. Gün

  1. 1X PBS 3 kez, 10 'oda sıcaklığında her kasları yıkayın.
  2. Oda sıcaklığında 1 saat (bkz. Tablo) çözümü engelleme ikincil antikor kokteyli ekleyin. Foto-Alexa-Fluor 647 floresan beyazlatma önlemek için kasların bu adımı itibaren ışıktan korunmalıdır.
  3. 1X PBS 3 kez, 10 ', her kasları yıkayın.
  4. 1X PBS içinde kalan bağ dokusu Temiz, LAL kasların lateral sınırları kesilmiş ve slaytlar dorsal tarafına monte cam kapak fişleri ve montaj medya kullanarak. Yerinde kapak kayma güvenliğini sağlamak için açık bir oje kullanın.
  5. Analiz için hazır olana kadar -20 ° C'de ışık ve mağaza slaytlar koruyun.

5. LAL NMJs Konfokal görüntüleme

  1. Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüler, Leica TCS 4D konfokal mikroskop Leica Planı Apo 63X yağ objektif (1.4NA) ile elde edilir.
  2. Floresein ve Alexa 647 sinyalleri aynı anda sırasıyla, lazer çizgileri 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) ve 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW) ile tarandı. Sırayla, rodamin sinyal sonra lazer hattı ile 561 nm (DPSS, 561, 20 mW) taranır. Optik bölümleri 0.3 mikron aralıklarla toplanan ve z-düzleminde görüntü sayısı 60-80 arasında değişiyordu. Iğne deliği Airy 1 (107,97 um) göre ayarlanır. Görüntü formatı 1024 x 1024 (X, Y), az 1 234,32 mm x 234,32 mm ve 229,05 nm x 229,05 nm piksel boyutunda bir görüntü boyutu 400Hz hızlı bir zoom faktörü.
  3. Leica TCS-NT kazanım yazılım sonra maksimum yoğunluğu projeksiyonları z serisi görüntüleri yeniden oluşturmak için kullanılır.
  4. Multipanel görüntüleri Adobe Photoshop kullanarak, parlaklık ve kontrast ayarlanır.
  5. Tipik bir LAL kas için, biri yaklaşık 75-100 tr yüz NMJs analiz etmek gerekir. Synaptic istikrar gibi pre-, peri-ve postsinaptik unsurların mekansal uyumu (yani sinir, Schwann hücreleri ve kas) gibi özellikleri ve sinaptik alan ölçümleri (yani sinaps boyutu) tarafından belirlenir.

Temsilcisi sonuçları:

Nikotinik AChRs postsinaptik kümeleri (Kırmızı Şekil 2) tam apposed tek bir kas lifi, yetişkin bir memeli NMJ, tek bir motor akson son derece sinir terminal farklılaşmış milleri (Yeşil Şekil 2) formunu ince dalları ayrıntılarına . Perisynaptically, terminal Schwann hücreleri sıkı presinaptik sinir terminalleri (Blue Şekil 2) tüm dallarını kapsamaktadır. Bu üçlü organizasyonun yapısal ve işlevsel bütünlüğü ciddi alt tipi özel mAChR inhibitörleri günlük uygulama tarafından rahatsız. Burada sunulan örnek (Şekil 3), 4-DAMP, M1, M3, M4 ve M5 mAChR alt tipleri için yüksek afinite ile mAChR antagonisti (Şekil 3B, kas yüzeyi boyunca sayısız NMJs sinir terminallerine seçici eleme çağrıştırıyor C). Buna ek olarak, terminal Schwann hücrelerinin süreç uzantısı olmadan parlak S100 etiketleme (Şekil 3B, 3C) ile kanıtlanan 8 anormal suskun. Postsynaptically, kas lifleri normal ve nAChRs, hiçbir kayıp vardır (Şekil 3B, 3C).

Şekil 1
Şekil 1 LAL kas Anatomik yeri ve organizasyonu. Rostral (rLAL), kaudal (cLAL) ve LAL sinir (LALn) ve buna karşılık gelen uç plakası bantları yeri (A, içerlek) gösterilmiştir. LAL kas göre iğne konumu ve enjeksiyon işlemi (B) gösterilmiştir. Kesi noktaları diseksiyon prosedürü (C) gösterilmiştir.

Şekil 2
Şekil 2 NMJ Üçlü organizasyonu. Yüksek büyütmeli bir fare NMJ konfokal kez. Tek bir akson terminal Schwann hücresi ve süreçler (terminali Schwann hücre gövdeleri A ', yıldızlarla noktası) tarafından sıkıca kapalı ince terminal dalların (A), ayrıntılarına. Postsynaptically bir kas lifi, nikotinik AChRs bir küme hassas sinir terminaline dalları apposed.yalleri ve terminal Schwann hücresi.

Şekil 3
Şekil 3 LAL kasları 4-DAMP, mAChR antagonisti ile tedavi. LAL kasların Düşük ve yüksek büyütmeli konfokal kez araç ya da 4-DAMP ile tedavi edildi. Araç ile tedavi edilen kas (4 DAMP tedavi kas eksikliği sinir terminalleri (A-A'''), sayısız NMJs aksine B-B ', C-C'''). Şekil 2B kutulu alan Şekil 2C yakınlaştırılmış.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan yöntem memeli NMJs istikrar ve bakım sinyalizasyon alt tipi özel mAChR önceden tanınmayan rolleri soruşturma izin verir. Bu yöntem ayrıca nörotrofik faktörler ve farmakolojik ajanların etkilerini test etmek için faydalı olacaktır. Örneğin, laboratuar Silier Nörotrofik Faktör (CNTF) yetişkin farelerde neredeyse tüm LAL sinir terminallerinden çimlenme yol açtığını 1 . Bu sonuç ca az çimlenme orta bildirdi CNTF ile tedavi edilen arka bacak kasları, önceki çalışmalarla tezat. Gluteus ve yanal gastrokne...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma Müsküler Distrofi Derneği, NIH (NS062320) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifin Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
ketamin Hospira NDC0409-2051-05 Doz: 120mg/kg
ksilizin Lloyd Laboratuvarları LA33806 Doz: 8mg/kg
atropin Sigma-Aldrich A0132 (>% 98 saflıkta); Doz: 0.2mg/kg - 20mg/kg
atropin Voigt Global Dağıtım AT105 İlaç grade
Methoctramine Sigma-Aldrich M105 Doz: 100 - 400M
4-DAMP Sigma-Aldrich D142 Doz: 2.5mg/kg
AFDX-116 Bioscience Tocris 1105 250M
AFDX-384 Bioscience Tocris 1345 50M - 500M
MT 7 Peptitler Uluslararası PMT-4340-s 0.1M - 1M
1X Fosfat Tuzlu, pH 7.4 Tamponlu Invitrogen 10010049
Paraformaldehit Balıkçı T353-500 10g/100mL deiyonize distile su eriterek ilk% 10'luk olun; 1X PBS ile% 4, pH 7.4 'e ayarlamak
Pentobarbitol Sodyum Virbac Hayvan Sağlık NDC-051.311-050-01 Doz: 390mg/kg
Sylgard Dow Corning Bölüm # 184 Ihtiyaçlarına bağlı olarak birden fazla ölçekli kültür çanak kullanabilirsiniz (30mm, 60mm, 100mm), kit ile birlikte gelen yönergeleri izleyin
0.1M Glycine Sigma-Aldrich G-7126 % 2 BSA / PBS 0.185g için 25ml
% 2 Sığır serum albumin (% 2 BSA) Sigma-Aldrich A3059-100g 1X PBS 100 ml içine 2g BSA çözülür
% 2% 0.2 Triton X 100 BSA / PBS (Engelleme Tampon) Sigma-Aldrich T9284-100 ml 0.2ml/100mL% 2 BSA / PBS çözülür
α-bungarotoxin Invitrogen T1175 1:200, konsantrasyon kullanın
SMI-312 Sternberger Monoclonals SMI312 1:1000 konsantrasyon kullanın
SV2 Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası SV2-Süzüntü 1:10 konsantrasyonda kullanın
S100 Dako Z0311 1:400, konsantrasyon kullanın
FITC-keçi anti-fare IgG1 Roche 03117731001 Konsantrasyonu 1:200 kullanın, ama arka planda yüksek ise, 1:400 deneyin
Alexa Fluor 647 konjuge keçi anti-tavşan Invitrogen A21244 1:200, konsantrasyon kullanın
Vectashield floresan montaj medya Vektör laboratuvarlar H-1000 Bu sert ayarlanmış bir medya değil, açık bir oje ile kapak kayma güvenliğini sağlamak için gerekecektir.
Küçük Bahar Makas Güzel Bilim Araçları 15002-08
Diseksiyon forseps Güzel Bilim Araçları 11295-51

Kaynaklar

  1. Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
  2. Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
  3. Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
  4. Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
  5. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
  6. Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
  7. Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
  8. Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
  9. Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
  10. Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
  11. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
  12. Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
  13. Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Konfokal MikroskopiN rom sk ler Bile kelerFare Modelila Uygulamasmm nohistokimyasal Y ntemlerMorfolojik Analiz
Subkutan Muskarinik Antagonistleri Yönetim ve Farelerde levator Auris longus'un Triple-immün
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.