Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Hipokampal Organotipik Dilim Hazırlama ve Kültür
>NOT: Bu protokol, organotipik hipokampal dilimlerin üretilmesine izin verir. İdeal olarak, her adımın hızlı bir şekilde yapılmasını sağlamak ve dilimlerin kalitesinden ödün vermemek için bir seansta üçten fazla hayvana ötenazi yapılmamalı ve diseksiyon yapılmamalıdır. Baştan sona aseptik bir teknik kullanın.
- Diseksiyon protokolüne başlamadan önce aşağıdaki adımların atıldığından emin olun.
- Hazırlayın ve filtreleyin, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak tüm solüsyonları önceden sterilize edin.
- Saklama kaplarını ve Petri kaplarını her zaman ıslak buz üzerinde metal bir ısı emici üzerinde tutarak saklama sırasında ve beyin diseksiyonu ve hipokampal dilim hazırlama sırasında çözeltileri 4 ° C'de tutun.
- Tüm metal aletleri, yüzükleri ve kağıt mendilleri otoklavlayın.
- Protokolün her adımı için kullanılacak tüm alet ve malzemelerin kullanıma hazır olduğundan, önceden düzenlendiğinden ve %70 etanol püskürtüldüğünden emin olun. Ardından soğumalarını ve kurumasını bekleyin.
- 5-7 günlük bir C57BL/6N fare yavrusunu servikal çıkık ile ötenazi yapın ve tüm cilt yüzeyini %70 etanole batırılmış steril kağıt mendille kısa bir süre silin. Cildi kurulayın ve Mayonez makası kullanarak yavrunun kafasını kesin.
- Kafa derisini başın orta hattı boyunca, oksipital bölgeden başlayıp burnun yakınında biten iris makasıyla kesin ve yanal olarak geri çekin.
- Vannas makasının ucunu foramen magnuma sokun ve enine sinüsler boyunca kemik üzerinde iki küçük yanal kesi yapın, ardından kafatasını orta hat boyunca koku soğancığına kadar kesin ve bu bölgede orta hatta dik olarak iki küçük kesi yapın.
- İnce uçlu kavisli forseps kullanarak, kemik fleplerini orta hattan yanal olarak geri çekin. Beyni küçük bir spatula ile dikkatlice çıkarın ve bir "diseksiyon ortamı" içeren 90 mm'lik silikon elastomer kaplı bir Petri kabına aktarın.
not: Diseksiyon ortamı Gey'in dengeli tuz çözeltisidir (5 mg/mL D-glukoz, %1 antibiyotik-antimikotik solüsyon, 10.000 ünite/mL penisilin, 10 mg/mL streptomisin ve 25 μg/mL amfoterisin B).
- Beyinciği çıkarın ve bir tıraş bıçağı kullanarak orta hat boyunca serebral hemisferleri ayırın. Serebral hemisferleri taze, buz gibi soğuk diseksiyon ortamı ile doldurulmuş yeni bir 90 mm silikon elastomer kaplı Petri kabına aktarmak için bir spatula kullanın. Bir seansta birden fazla hayvan kullanılacaksa, Adım 1.2–1.6'yı tekrarlayın.
- Stereomikroskop altında, koku alma ampulünü ve frontal korteksin ucunu bir jiletle kesin ve ince uçlu forseps kullanarak serebral korteksi serebral dokunun geri kalanından ayırın. Bu adım, hipokampusu kortikal dokunun medial yüzeyinde açıkta bırakır. Bu adımdan itibaren, laminer akışlı bir doku kültürü başlığı kullanın (ultraviyole sterilize edilmiş ve% 70 etanol çözeltisi ile temizlenmiştir).
- Buz gibi soğuk diseksiyon ortamını düz bir plastik doğrama diskine uygulayın ve bir spatula kullanarak beyin dokusunu, korteksin medial yüzeyi yukarı bakacak ve hipokampusun ekseni doğrama bıçağının eksenine dik olacak şekilde disk üzerine yerleştirin.
- İnce uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak diseksiyon ortamını doğrama diskinden mümkün olduğunca çıkarın.
- Beyni %50 doğrama hızı ve kuvvetinde bir doku doğrayıcı kullanarak 400 μm'lik dilimler halinde kesin.
not: Beyin dokusu diseksiyon ortamına batırılmadığı için bu adım mümkün olduğunca çabuk tamamlanmalıdır.
- Silikon elastomer kaplı Petri kabındaki diseksiyon ortamını taze buz gibi soğuk ortamla değiştirin.
- Doku kıyıcı bittiğinde, beyin dokusunu dikkatlice yeni bir diseksiyon ortamına daldırın ve kesilen dokuyu düz bıçaklı bir neşter kullanarak 90 mm silikon elastomer kaplı Petri kabına geri aktarın.
- Stereomikroskop altında, ince uçlu forseps kullanarak kortikal dilimleri dikkatlice ayırın. Her dilim için, hipokampusu diseksiyon veya dilimlemeden kaynaklanan morfoloji ve potansiyel doku hasarı açısından inceleyin.
- İnce uçlu forseps ve küçük Vannas makası kullanarak hipokampusu entorinal korteksten ve fimbriadan ayırın. Tipik olarak, yarım küre başına yaklaşık 6 ila 8 hipokampal dilim üretilir.
- Kesilmiş bir Pasteur pipeti kullanarak 6 adede kadar hipokampal dilimi bir doku kültürü ekine aktarın ve 35 mm'lik bir Petri kabının içine yerleştirin. Dilimlerin birkaç milimetre aralıklarla yayıldığından emin olun (bu, her dilimin ayrı ayrı görüntülenebilmesini sağlayacaktır).
- Hemen her bir Petri kabının altına, doku kültürü ekinin altına, doku kültürü ekinin üst kısmının hemen altına buz gibi soğuk "büyüme ortamı" ekleyin.
not: Büyüme ortamı %50 Minimum esansiyel ortam Eagle, %25 Hanks' dengeli tuz çözeltisi, %25 at serumu, 5 mg/mL D-glikoz, 2 mmol/L L-glutamin, %1 antibiyotik-antimikotik çözelti ve 10 mmol/L HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit), sodyum hidroksit ile pH 7.2'ye titre edilmiştir.
- Diseksiyondan sonraki gün ve bundan sonra her 2 ila 3 günde bir büyüme ortamını değiştirin (37 ° C'de büyüme ortamı kullanın). Büyüme ortamının yeterince eklendiğinden, ancak doku dilimlerinin canlılığını tehlikeye atabilecek şekilde doku kültürü ekleme zarı üzerinden taşacak kadar fazla olmadığından emin olun.
- Deneylerde kullanılmadan önce, doku dilimlerini 12 ila 14 gün boyunca havada% 5 karbondioksit ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun.
2. Deneysel Blast TBI Protokolü için Hipokampal Organotipik Dilimlerin Hazırlanması
NOT: Bu bölümün adımları, görüntüleme hariç, laminer akışlı doku kültürü başlığında gerçekleşir.
- Özel yapım paslanmaz çelik halkaları 6 oyuklu bir plakaya (her kuyucuk için bir tane) yerleştirin.
NOTLAR: Halkaların çentikli bir kenarı vardır (saat 12 konumunda oturmalıdır) ve kuyucukların içine sıkıca otururken, doku kültürü ekleri bu kenara kolayca oturur. Halkaların bakterisidal bir dezenfektanla yıkandığından, arıtılmış suyla iyice durulandığından, otoklavlandığından ve önceden soğumaya bırakıldığından emin olun.
- 6 oyuklu plakanın kuyusunu propidium iyodür içeren önceden ısıtılmış (37 ° C) serumsuz "deneysel ortam" ile doldurun.
not: Probidyum iyodür içeren deneysel ortam, %75 Minimum esansiyel ortam Eagle, %25 Hanks'in dengeli tuz çözeltisi, 5 mg/mL D-glikoz, 2 mmol/L L-glutamin, %1 antibiyotik-antimikotik çözelti, 10 mmol/L HEPES ve 4.5 μmol/L propidyum iyodür, sodyum hidroksit ile pH'ı 7.2'ye titre eder.
- Orta seviyenin halkanın çentiğinin üzerine çıkmadığından emin olun. Doku kültürü ekleri aktarılmadan hemen önce ortamın 37 °C'de olduğundan emin olmak için halkalarla birlikte 6 oyuklu plakayı 1 saat boyunca inkübatöre geri aktarın.
- 35 mm'lik Petri kaplarından organotipik dilimlerle birlikte doku kültürü eklerini, halkalar ve forseps ile deney ortamı ile 6 oyuklu plakaya aktarın.
- Kalıcı bir keçeli kalemle saat 3 konumunda ek kenara bir nokta yapın.
not: Ekler, deney sırasında 6 oyuklu plakadan çıkarılacaktır. Bu adım, şok dalgasına maruz kaldıktan sonra kesici ucun orijinal konumuna geri dönmesini kolaylaştırır ve protokol boyunca her dilimi kolayca takip eder.
- Her 6 oyuklu plakayı benzersiz bir isim ve tarihle etiketleyin ve her bir plakanın kuyucuklarının bir haritasını yapın, her bir oyuğu (örneğin, A, B, C, vb.) ve her bir oyuktaki her dilimi (örneğin, 1, 2, 3, vb.) adlandırın, böylece her dilimin benzersiz bir tanımlayıcısı olur (örneğin, A1, A2, A3, vb.).
- Dilimlerin 37 °C'de olduğundan emin olmak için 6 oyuklu plakayı görüntülemeden hemen önce 1 saat inkübatöre aktarın.
not: Doku kültürü ekleme zarının altında, dilimlerin canlılığını tehlikeye atabilecek taşan ortam veya hava kabarcıklarından kaçının.
- Deney ortamına aktarıldıktan 1 saat sonra, yaralanma protokolü gerçekleştirilmeden önce dilim sağlığını değerlendirmek için uygun bir uyarma (BP 535/50 nm) ve emisyon (LP 610 nm) filtresi ile donatılmış bir floresan mikroskobu (2X objektif, NA 0.06) kullanarak her dilimi ayrı ayrı görüntüleyin.
Notlar: Bu aşamada yoğun kırmızı lekelenme alanları sergileyen dilimlerin, tehlikeye atılmış canlılık sunduğu düşünülmeli ve daha fazla analizden çıkarılmalıdır (bunlar tipik olarak üretilen toplam dilim sayısının %10'undan daha azını temsil eder). Dilimlerin inkübatörün dışında kaldığı süreyi en aza indirmek için görüntülemenin sırayla ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yapıldığından emin olun (tipik olarak 6 kuyucuğun görüntülenmesi 30 dakikadan biraz daha kısa sürmelidir).
- 6 oyuklu plakanın kapağını her zaman açık tutun. Kapağın iç kısmında bir miktar yoğuşma birikebilir. Böyle bir durumda, kısa bir süre için düşük ayarda bir saç kurutma makinesi kullanın.
- Tüm görüntüleme koşullarının farklı günlerde ve deneyler arasında aynı olduğundan emin olun.
not: Görüntülemenin amacı doku floresansını ölçmektir; Bu nedenle, bu adım, sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak ve verilerin karşılaştırılmasına izin vermek için önemlidir.
3. Doku Kültürü Eklerinin Hipokampal Organotipik Dilimlerle Daldırılması ve Taşınması
- Görüntülemeden hemen sonra, bir laminer akış başlığında, forseps kullanılarak 6 oyuklu plakadan bir doku kültürü alınır.
- Eki, %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile taze köpürtülmüş 20 mL ılık (37 °C) deneysel ortam ile önceden doldurulmuş steril bir polietilen torbaya (5" x 5") dikkatlice aktarın.
not: Oksijen ve karbondioksit ile zenginleştirilmiş deney ortamının, bir Dreschel şişesi içinde sininterlenmiş bir cam fıskiye kullanılarak %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile en az 40 dakika köpürtüldüğünden ve bakteri filtreli 20 mL'lik bir şırınga ve steril bir doldurma tüpü (127 mm) takılı laminer akışlı doku kültürü başlığı içindeki steril polietilen torbalara aktarıldığından emin olun. Torbaları hemen kapatın ve doku kültürü insert transferinden önce en az 1 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın.
- Her steril torbanın doğru şekilde etiketlendiğinden emin olun (plaka ve iyi tanımlama ile). Her doku kültürü eki için bu adımı tekrarlayın. Steril torbaları kapattıktan sonra hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın (torbaların üst kısmını bükerek ve plastik bir kelepçe uygulayarak güvenli bir şekilde yapılır).
- Doku kültürü ekleri ile steril torbaları ve deney ortamı içeren 6 oyuklu plakaları 37 °C inkübatöre geri koyun.
- 1 saat sonra, organotipik dilimleri şok dalgasına maruz kalma protokolü boyunca fizyolojik sıcaklıkta tutmak için steril torbaları doku kültürü ekleri ile birlikte 37 ° C'de deiyonize su ile doldurulmuş plastik kutulara dikkatlice paketleyin.
4. Şok Tüpünün Hazırlanması ve Hipokampal Organotipik Dilim Şok Dalgasına Maruz Kalma
- Şok tüpünü hazırlarken ve şok dalgasını açığa çıkarırken çelik burunlu koruyucu botlar, laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin.
- Steril torba tutucu çerçevesini şok tüpünün distal flanşına cıvatalayın ve merkezi deliğin şok tüpü çıkışıyla hizalandığından emin olun (bir kör çubuk kullanarak).
- İki basınç transdüserini radyal olarak monte edin: sensör 1 tahrik edilen bölümün orta kısmına ve sensör 2 şok tüpünün distal flanşına (Şekil 1A). Basınç transdüserlerini bir akım kaynağı güç ünitesi aracılığıyla bir osiloskopa bağlayın.
- Tüm şok borusu tahliye vanalarının ve akış kontrollerinin kapalı olduğundan emin olun.
- Harici basınçlı hava hattını açın ve solenoid valfi 2,5 bar'a kadar şarj edin.
- Basınçlı hava silindiri emniyet valfini açın ve basıncı yaklaşık 5 bar'a çıkarmak için basınç regülatörünü yavaşça açın.
NOT: Bu regülatör için ayarlanan basınç, en yüksek diyafram patlama basıncının biraz üzerinde olmalıdır.
- 23 μm kalınlığındaki polyester levhaları 10 x 10 cm2 kareler halinde keserek diyaframları hazırlayın. Kolları otoklav bandı kullanarak hazırlayın ve her diyaframın üstüne ve altına yapıştırın.
- Makata bir diyafram (çift kama - tek diyafram konfigürasyonunun tek yuvası) veya iki diyaframı (çift kama - çift diyafram konfigürasyonunun her iki yuvası) yerleştirin (Şekil 1B).
- Diyaframları ortalayın ve dört M24 cıvata ve somun kullanarak sıkıştırın, çapraz simetrik bir şekilde sırayla sabitleyin ve diyaframların kırışıksız olduğundan emin olun.
- Organotipik hipokampal dilimlerle doku kültürü eklerinin yüzeyinin şok tüpü çıkışına baktığından ve doku kültürü ekinin steril torbanın içinde ortalandığından emin olarak, her bir steril torbayı tutucu çerçeve üzerinde dikey konumda ayrı ayrı sıkıştırın (Şekil 1C). Sağlam ve eşit bir immobilizasyon sağlamak için steril torbanın her tarafına güvenli bir şekilde kenetlendiğinden emin olun.
- Şok tüpüne basınç uygularken kulak koruyucular ve koruyucu gözlükler takın. Şok dalgası verilerini (50 mega örnek/sn toplama hızı, kayıt uzunluğu 20 ms, 1 milyon nokta) elde etmek için mevcut kaynak güç ünitesini ve osiloskopu açın ve solenoid valfi kapatın.
- Şok tüpü kontrol panelindeki akış kontrol düğmesini kullanarak, tek diyafram konfigürasyonu için şok tüpünün sürücü ses bölümüne veya çift diyafram konfigürasyonu için şok tüpünün hem sürücü hacim bölümüne hem de çift makat bölümüne yavaşça basınç uygulayın.
not: Tek diyafram konfigürasyonu için, patlama basıncı yalnızca diyafram malzemesine ve kalınlığına bağlı olacaktır ve malzeme patlama basıncına ulaşıldığında diyafram kendiliğinden yırtılacaktır. Çift diyafram konfigürasyonu için, patlama basıncı aynı zamanda hem sürücü hem de çift kama odacıklarındaki gaz basıncı farkına da bağlı olacaktır ve diyaframların kontrollü bir şekilde patlaması için, hedef basınçlara ulaşıldığında çift kama emniyet valfi manuel olarak açılır.
- Diyafram yırtılır yırtılmaz (yüksek bir ses çıkarır), akış düğmesini kullanarak basınçlı hava akışını hızla kapatın ve solenoid valfi açın.
not: Sürücü bölümünün toplam hacmi, körleme segmentlerinin yerleştirilmesiyle değiştirilebilir, bu da daha geniş bir şok dalgası tepe aşırı basıncı ve sürelerinin elde edilmesine izin verir. Şok dalgası parametrelerinin ideal kombinasyonu, doku hasarına neden olmak için yeterli olmalı, ancak doku kültürünün yerleştirilmesine veya steril torba distorsiyonuna veya yırtılmasına neden olacak kadar yüksek olmamalıdır.
- Her bir steril torbayı doku kültürü ile maruz bırakın, tek bir şok tüpü dalgasına yerleştirin ve kutudan yeni bir steril torba alınmadan ve tutucu çerçeveye kenetlenmeden önce hemen ısı ayarlı kutuya geri koyun. 37 °C'nin altındaki sıcaklıklar yaralanma gelişimini engelleyebileceğinden, deney ortamının soğumasını önlemek için Adım 4.10–4.14'ün mümkün olduğunca sorunsuz ve hızlı bir şekilde (birkaç dakika içinde) gerçekleştirildiğinden emin olun.
- Tüm doku kültürü ekleri bir şok dalgasına (veya sahte protokole) maruz kaldıktan sonra, bunları orijinal 6 oyuklu plakaya ve ilgili kuyucuğuna (laminer akışlı doku kültürü başlığının içinde) geri koyun ve inkübatöre geri dönün.
- 6 oyuklu plakayı, daha fazla görüntülemeye kadar 37 ° C'de havada% 5 karbondioksit bulunan inkübatörde tutun.
- Her deney için sahte kontrolleri ve dilim şok dalgası maruziyetini dahil edin.
not: Sahte dilimler, bir şok dalgasına maruz kalan dilimlerle aynı şekilde muamele edilir (deneysel ortamla steril torbalarda kapatılır, aynı termo-regülasyonlu kutuda şok tüpü laboratuvarına taşınır ve eşdeğer bir süre boyunca metal çerçeve üzerinde asılı kalır), ancak şok tüpü ateşlenmez.
