Amiloid Peptit Enjeksiyonu ile Zebra Balığı Beyninde Alzheimer Hastalığı Modeli Oluşturulması

Özet

Bhattarai, P., et al. Yetişkin Zebra Balığı Beyninde Amiloid-β42 Toksisitesinin ve Nörodejenerasyonunun Modellenmesi. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, Alzheimer hastalığında görülen nöronal hasarı taklit ederek amiloid toksisitesi oluşturmak için yetişkin zebra balıklarının ön beynine monomerik amiloid peptitlerin enjekte edilmesi prosedürünü göstermektedir

Protokol

1. Aβ42 Peptidinin Hazırlanması

1. Otomatik bir katı faz peptit sentezleyici üzerinde birleştirme reaktifi olarak 2- (1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronoiumhekzaflorfosfat (HBTU) ile standart 9-florenil metoksikarbonil (Fmoc) kimyasını kullanarak peptitleri sentezleyin (bkz. Tablo 1). Sentez ölçeği 100 μmol idi.
2. Otomatik peptit sentezleyiciyi katı faz olarak 500 mg Fmoc korumalı reçine ile yükleyin (0,2 mmol/g yükleme kapasitesi). Çözünmüş Fmoc korumalı amino asitleri, gereken hacimde ve ilgili sentezleyici için hesaplandığı şekilde 0,5 M'lik bir konsantrasyonda yükleyin.
   not: Hesaplamalar, her bir Fmoc korumalı amino asidin, her bir yapı taşından 5 kat fazla olacak şekilde iki kez reçineye bağlanmasını sağlamak için yapılır.
3. Peptit sentezi için gerekli reaktifleri dimetilformamid (DMF) içinde çözün. Örneğin, aktivatörü, HBTU'yu 0.48 M, %45 v/v N-Metilmorfolin (NMM) (baz) ve %5 v/v Asetik Anhidrit (kapak karışımı) konsantrasyonunda hazırlayın.
4. Trifloroasetik asit (TFA): triizopropilsilan (TIS): su: ditiyotreitol (DTT) 90 (v/v): 5 (h/v): 2.5 (h/v): 2.5 (m/v) 4 saat boyunca 100 (h/v) 100 μmol sentez ölçeği için 10 mL kullanın.
5. Bölünme karışımını 100 mL buz gibi soğuk dietil etere ekleyerek parçalanmış ürünü çökeltin. Gözenek boyutu 0,45 μm olan Politetrafloroetilen (PTFE) filtre içeren bir filtrasyon ünitesinden geçirin ve 20 mL buz gibi dietil eter ile yıkayın.
6. Filtrelenmiş peptidi filtre kağıdından toplayın ve 100 mg çökeltilmiş peptidi 5 mL damıtılmış deiyonize su içinde çözün: 1: 1'de asetonitril.
7. Boncuk boyutu 10 μm olan gözenekli bir polistiren divinilbenzen kolonu ile donatılmış yarı hazırlayıcı bir HPLC üzerinde ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırın.
   1. Kolonu önceden ısıtın ve bir kolon ısıtma cihazı kullanarak 50 °C'de tutun. 4 mL/dk'da 25 dakika boyunca %5'ten %100'e kadar bir çözücü B gradyanı uygulayarak otomatik bir fraksiyon
      not: Çözücü A, suda %0.1 TFA'dır ve çözücü B, asetonitrilde %0.1 TFA'dır.
   2. Kromatogramı 220 nm'de izleyin, uygun tepe noktalarını toplayın ve sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) kullanarak analiz edin.
8. Numuneyi analitik bir C18 kolonundan (boncuk boyutu 1,7 μm) geçirirken bir ultraviyole (UV) Dedektörü ile izleyerek 220 nm'de analitik ters fazlı ultra yüksek basınçlı sıvı Kromatografisi (UPLC) ile saflığı onaylayın. Peptit ürününü kütle spektrometresi ile onaylayın.
   not: UPLC, bir elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS) ve Tandem Dört Kutuplu Dedektör ile birleştirilmiştir.
9. Kabarık bir toza 0.052 mbar'lık bir vakum uygulayarak istenen peptidin doğru fraksiyonlarını yuvarlak tabanlı bir şişede liyofilize edin. Vakum pompasını -78 °C'de tutulan bir dondurma ünitesine bağlayın. -80 °C'de süresiz olarak saklayın.
10. Deneyler için 1: 1: 1'de asetonitril, DMF ve analitik dereceli su karışımında 1 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için liyofilize peptidi kullanın. Bu çözelti, peptitler içinde toplanmadığı için en az 6 ay saklanabilir.

2. Enjeksiyon Karışımının Hazırlanması

1. Liyofilize peptitleri seyreltmek için fosfat tamponlu salin (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7.4) hazırlayın.
2. Peptidi PBS'de 20 μM'lik bir nihai konsantrasyona çözün. Bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın. İyice karıştırın ve enjeksiyona kadar buz üzerinde saklayın. Çözeltide toplanmayı önlemek için 30 dakikayı aşmayın.

3. Anestezi

1. Sirkülasyon sisteminden gelen normal balık suyunda anestezikler,% 0.1 etil-m-aminobenzoat metansülfonat (MESAB) stok çözeltisini hazırlayın. Anestezi solüsyonunu %0.0025 (h/h) nihai konsantrasyona hazırlayın.
2. İstenilen sayıda balığı tanklarından 5 L sistem suyu ile bir taşıma kabına boşaltın.
3. Plastik bir Petri kabını (90 mm) 40 mL anesteziklerle yarıya kadar doldurun. Bu çanağı enjeksiyonlar için kullanın.
4. Operküler hareket durana kadar balıkları anesteziklerde kuluçkaya yatırın.

4. Serebrovventriküler Mikroenjeksiyon

1. Enjeksiyon aparatının hazırlanması
   1. Aşağıdaki parametrelere sahip bir iğne çektirmesi kullanarak cam enjeksiyon kılcal damarlarını hazırlayın: ısıtma döngüsü, 537; çekme döngüsü, 250; hız, 1,5 s; zaman, 80 ms.
   2. Basınç kaynağındaki basınç ayarını 25 psi'ye getirin.
   3. Mikroenjektör parametrelerini tutma için 20 psi ve çıkarma için 10 psi, periyot için 2.5 ve geçit için 100 ms olarak ayarlayın.
   4. Cam kılcal damarı enjeksiyon solüsyonu ile doldurun. Cam kılcal damarı mikroenjeksiyon tutucusuna yerleştirin. Enjeksiyon açısını 45°'ye ayarlayın.
2. Bir balığı anestezi solüsyonu ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına koyun.
3. Balıkları forseps ile tutun ve enjeksiyon için yönlendirin.
4. Kafatasındaki 30 G'lik bir iğnenin ucunu kullanarak, iki yanal plakanın birleştiği optik tektum üzerinde bir yarık oluşturun. Ucu beyin dokusuna sokmayın, bu kanamaya ve hasara neden olur.
5. Cam kılcal damarı yarığa yerleştirin.
   1. İğnenin sadece ucunu kullanın ve kafatasından 1 mm'den fazla nüfuz etmeyin. Balığı tutmaya devam edin ve cam kılcal damarın ucunu kesi bölgesinden geçirin.
   2. Cam kılcal damarın ucunu 45°'lik bir açıyla telensefalona doğru yönlendirin. Çözeltiden 1 μL enjekte edin. Sıvı, enjeksiyondan hemen sonra dağılır.

5. Kurtarma

1. Balıkları iyileşene kadar bir taşıma kabına geri koyun. Optimum su kalitesini sağlamak için kabı düzenli olarak dolaşan balık suyuna bağlayın.
   not: Kurtarma normalde 1 dakika sürmelidir. Daha uzun sürerse, balık anestezikte daha kısa süre tutulmalıdır (deneycinin bunu optimize etmesi gerekir).

Sonuçlar

Tablo 1: Aβ42 ve TR-Aβ42 peptit dizileri.

Serisi <...

peptit	Peptit Dizisi	MW (g/mol)
Aβ42	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	4514.1
TR-Aβ42	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fmoc korumalı amino asitler	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya)		Katı faz peptit sentezi (SPPS) için Fmoc bazlı amino asitler
N, N, N', N'-Tetrametil-O- (1H-benzotriazol-1-il) üronyum hekzaflorofosfat (HBTU)	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya)	RL-1030	Aktivatör
Oksima	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya)	RL-1180	Rasemizizasyon baskılayıcı
N,N-Diizopropilaminlamin	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya)	SOL-003 Serisi	taban
Dimetilformamid	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya)	SOL-004	çözücü
N-Metilmorfolin	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Almanya	A12158	taban
1-Hidroksibenzotriazol hidrat (HOBT)	Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, ABD)	157260 ALDRICH	Aktivatör
Piperidin	MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya)	822299	Fmoc koruma koruma reaktifi
Diklormetan (DCM)	MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya)	106050	çözücü
Formik asit (FA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya)	100264	HPLC için tampon bileşeni
Trifloroasetik asit (TFA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya)	808260	Clevage Karışım reaktifi
Triizopropilsilan (TIS)	MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya)	233781 ALDRICH	Clevage Karışım reaktifi
Asetonitril (UPLC/LCMS için)	Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH	34967-1L	çözücü
Asetonitril (HPLC için)	VWR International Ltd, İngiltere	83639.32	çözücü
Diyet Aleti	VWR International Ltd, İngiltere	23811.326	Peptit çökeltme için çözücü
Ditiotritol (DTT)	VWR International Ltd, İngiltere	0281-25G	Clevage Karışım reaktifi
TentaGel S RAM Fmoc pist amid reçinesi	Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Almanya)	S30023 Serisi	SPPS için katı faz
Peptit sentezi, dahil edilen filtrelerle 5 ml şırınga	Intavis AG (Köln, Almanya)	34.274	SPPS ve Katı Fazdan klevaj için reaksiyon tüpü
Politetrafloroetilen (PTFE) filtresi	Sartorius Stedtim (Aubagne, Fransa)	11806-50-N	Çökeltilmiş peptitlerin filtrelenmesi
Polivinilidenflorür (PVDF) şırınga filtresi	Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe	KC78.1	HPLC için ön filtreleme
Peptit Sentezleyici	Intavis, Köln, Almanya	ResPep SL	Otomatik katı fazlı peptit sentezleyici
Su İttifakı HPLC	Waters, Milford, Massachusetts, Amerika Birleşik Devletleri	Sular 2998, Sular e2695	Yarı hazırlayıcı ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)
PolymerX, boncuk boyutu 10μm, 250x10 mm	Phenomenex Ltd. Almanya	00G-4328-N0	Gözenekli polistiren divinilbenzen HPLC sütunu
Milli-Q Advantage A10, Milli-Q filtreli	EMD Millipore Şirketi, Billerica, MA, Amerika Birleşik Devletleri	LCPAK0001	Su arıtma sistemi
Filtrasyon Ünitesi	Sartorius Stedtim (Aubagne, Fransa)	16307	Peptit çökeltme için filtrasyon ünitesi
UV Dedektörlü UPLC Özelliği	Waters, Milford, Massachusetts, Amerika Birleşik Devletleri	M09UPA 664M	LC-MS için analitik ters faz ultra HPLC
AKLIYAT UPLC BEH C18, boncuk boyutu 1,7 μm, 50x2,1 MM	Waters, Milford, Massachusetts, Amerika Birleşik Devletleri	186002350	Analitik C18 sütunu
ACQUITY TQ Dedektörü	Waters, Milford, Massachusetts, Amerika Birleşik Devletleri	QBB908	Elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS)
MESİH ALFA 2-4 LD artı + vakuubrand RZ6	Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Almanya	16706, 101542	Vakum pompalı liyofilizatör
Paradigma plakası okuyucu	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.
MESAB (etil-m-aminobenzoat metansülfonat)	Sigma-Aldrich	A5040
Petri kapları	Sarstedt	821.472
Fosfat tamponlu tuzlu su	Yaşam Teknolojileri, GIBCO	10010-056
iğne	Becton-Dickinson	305178
Diseksiyon mikroskobu	Olimpos, Leica, Zeiss	Üreticiye göre değişir
Dumont Cımbız	Dünya Hassas Aletler	501985
Gillies Diseksiyon Forseps	Dünya Hassas Aletler	501265
Cam enjeksiyon kılcal damarlar	Dünya Hassas Aletler	TWF10
PicoNozul	Dünya Hassas Aletler	5430-12
Pnömatik PicoPump	Dünya Hassas Aletler	SYS-PV820 Serisi
Halka aydınlatıcı; Halka Işık Kılavuzu	Park Alanı Bilimsel	ILL-RLG

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Belediyesi adet · Serisi