Bir Alzheimer Hastalığı Modeli için Amiloid-Beta Proteinlerinin Doğrudan Stereotaksik Beyin İnfüzyonu

Özet

Kaynak: Jean, Y. Y. ve diğerleri, Oligomerik Amiloid-beta'nın Fare Hipokampüsüne Stereotaksik İnfüzyonu. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, Alzheimer hastalığının bir fare modelini oluşturmak için amiloid beta'nın dentat girusa kesin stereotaksik infüzyonunu göstermektedir. Amiloid beta proteinlerinin doğru koordinat tayini ve kontrollü iletimi, nöronal bozulmaya neden olur, hafıza işlemeyi bozar ve Alzheimer hastalığının gelişimine katkıda bulunur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Cerrahi Aletler ve Cerrahi Solüsyonlar Hazırlayın

1. Tüm paslanmaz çelik cerrahi aletleri otoklavlayın.
2. 200 geçirmez mutlak etanolü steril moleküler dereceli deiyonize damıtılmış su ile seyrelterek% 70 etanol hazırlayın.
3. 29 G iğneyi Hamilton şırıngasına takın. Hamilton şırınga ve iğnenin içini, nano saf suyu 1 dakika boyunca tekrar tekrar çekip çıkararak temizleyin. Bu işlemi %70 etanol ile tekrarlayın.
   1. Pistonu ve iğneyi Hamilton şırıngasından çıkarın. Parçaları laminer akış başlığı O/N içinde havayla kurutun.
   2. Kullanmadan önce iğneyi ve şırıngayı ultraviyole ışıkla 30 dakika ışınlayın.
4. Sodyum klorürü (NaCl) moleküler dereceli suda %0,9'luk nihai ağırlık-hacim konsantrasyonuna kadar çözerek bir tuzlu su çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 0,2 μm gözenekli bir filtreden süzerek sterilize edin.

2. Oligomerik amiloid-beta'yı (Aβ1-42) hazırlayın

1. Dimetilsülfoksit (DMSO) içinde rekombinant insan Aβ1-42'yi tam olarak Fa' ve diğerlerinin yayınında açıklandığı gibi 5 mM'ye monomerize edin ve yeniden süspanse edin.
2. Ameliyattan önceki gün 5 mM Aβ1-42'yi steril (1x) fosfat tamponlu salin (PBS) ile 100 μM'ye seyreltin.
3. Çözeltiyi öğüterek iyice karıştırın.
4. Aβ1-42 çözeltisini 4 ° C'de 12 saat inkübe edin.
   not: DMSO'nun PBS veya karıştırılmış / ters Aβ1-42 peptidi içinde seyreltilmesi gibi kontrol çözeltileri, Aβ1-42 ile aynı şekilde hazırlanmalıdır.

3. Enjeksiyon Koordinatlarını Belirleyin

1. İlgilenilen beyin bölgesi için tam ön-arka (AP), medial-lateral (ML) ve dorsal-ventral (DV) koordinatları belirlemek için yetişkin fare beyin atlasını kullanın.
   not: Tekniği göstermek için, hipokampusun dentat girusunu bregmadan aşağıdaki koordinatlarla hedef olarak seçtik: AP, -2.00 mm; ML, ±1,3 mm; DV, -2,2 mm'dir. AP değerinden önceki negatif işaret, bregmanın 2.00 mm arkada olduğunu gösterir. ML değerinden önceki ± işareti, merkezden sola ve sağa yönü gösterir. Son olarak, DV'den önceki negatif işaret, beynin yüzeyinden ventral olarak hareket ettiğini gösterir.

4. Stereotaksik Çerçeve Kurulumu

1. Cerrahi yüz maskesi, temiz bir laboratuvar önlüğü ve steril cerrahi eldiven giyin.
2. Stereotaksik aleti ve fare adaptörünü %70 etanol ile silin.
3. Tezgahın üzerine steril bir cerrahi örtü serin.
4. Stereotaksik aleti bir fare adaptörü ile steril cerrahi örtünün üzerine yerleştirin.
5. Fare ısıtma yastığını %70 etanol ile silin. Isıtma yastığını stereotaksik çerçeve yatağının üzerine yerleştirin. Isıtma yastığını fare adaptör yatağının üzerine bantlamak için genel amaçlı laboratuvar etiketleme bandı kullanın.
   1. Isıtma yastığını, üreticinin talimatlarına göre ılık su devridaim pompasına takın.
   2. Sıcak su devridaim pompasını açın, sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın ve bu sıcaklığa ulaşana kadar bekleyin.
6. 50 μl Hamilton şırıngayı 29 G'lik bir iğne ile stereotaksik çerçeveye, üreticinin talimatlarına göre motorlu dikey enjeksiyon miline vidalayarak yapıştırın.
7. Boncuk sterilizatörünü açın ve üreticinin önceden ayarladığı sıcaklığa ulaşana kadar bekleyin.
   not: Bu, hayvanlar arasında paslanmaz çelik aletleri sterilize etmek için kullanılır. Sterilizasyon için aletlerin boncuklarla 20 saniye temas etmesi gerekir.
8. Sıcak plakayı açın, 42 °C'ye ayarlayın ve üstüne temiz, boş bir kafes yerleştirin.
9. Hamilton şırıngası stereotaksik çerçeveye sabitlenirken, Aβ1-42 solüsyonunu hazırlamak için motorlu stereotaksik enjektörü kullanın.
   not: Şırıngaya 4 μl'den fazla çözelti çekin ve ardından enjeksiyon hacmini ayarlamak için stereotaksik enjektörü kullanın. Enjektörü üreticinin talimatlarına göre çalıştırın.

5. Hayvan Hazırlama

1. Tartı ölçeğini kullanarak farenin ağırlığını belirleyin.
2. Fareyi 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin ketamin / ksilazin kokteyli ile intraperitoneal (IP) enjekte ederek uyuşturun. Ayak parmağı sıkıştırma refleksinin kaybıyla anestezi derinliğini izleyin.
3. Fare sakinleştirildikten sonra, saç kesme makinesini alın ve kafatasının üzerindeki cildi açığa çıkarmak için başını tıraş edin.
4. Fareyi stereotaksik yatağın üstündeki ısıtma yastığının üzerine yerleştirin.
5. Ağzı açmak için spatulayı kullanın ve kesici dişleri diş koruyucusunun içine yerleştirin. Burunluğu farenin yüzünün üzerine sabitleyin. Nazikçe sıkıştırın ve çok sıkı değil.
6. Başı sabitlemek için iki taraflı kulak traverslerini işitsel meatusa yerleştirin. Her bir çapraz çubuğu kafatasına çarpana kadar hareket ettirin ve ardından kilitlemek için vidayı çevirin.
   1. Başın sabitlendiğinden emin olmak için, başınızı hafifçe aşağı bastırmak için işaret parmağınızı kullanın. Kafa düzgün bir şekilde sabitlenirse, basıldığında dışarı çıkmaz veya hareket etmez.
7. Nemli kalmaları için gözlere bir damla göz kremi veya bir göz damlası uygulayın. Cerrahi işlem boyunca gözlerin nemli olduğundan emin olun.
8. Cerrahi bölgeyi dezenfekte etmek için, kafatasının üzerindeki cilde betadin solüsyonu uygulamak için steril pamuklu çubuklar kullanın, ardından %70 etanol uygulayın. Alternatif betadin ve% 70 etanol temizliğini 2 kez daha gerçekleştirin.

6. Cerrahi ve İnfüzyon

1. Kafa derisinin orta hattında 2-3 mm'lik bir kesi yapmak için bir neşter kullanın ve ardından kesi hattını 1.0-1.5 cm'ye uzatmak için düz ince makas kullanın ve kafatasının sagital sütürü, bregma ve lambdasını ortaya çıkarın, stereotaksik koordinatların dayandığı yer işaretleri. Cildi ayrı tutmak için mikro kelepçeler kullanın.
   not: Bregma ve lambda pozisyonları "Stereotaksik Koordinatlarda Fare Beyni" adlı fare beyni atlasında açıklanmıştır.
2. Pamuklu bir bez alın, steril tuzlu suya batırın ve kafatasını temizlemek için kullanın. Ardından, kafatasını kurutmak için temiz ve kuru bir pamuklu çubuk kullanın.
3. Bregma üzerinde bir nokta işaretlemek için steril bir ince uçlu kalem kullanın. Hamilton şırıngasını, iğnenin ucu bregma üzerindeki noktaya değecek şekilde konumlandırmak için stereotaksik mikromanipülatörü kullanın.
   1. DV koordinatını kaydedin.
   2. Kafatasının AP ekseninin düz olup olmadığını kontrol etmek için Hamilton şırıngasını, iğnenin ucu lambda noktasına değecek şekilde arkaya doğru hareket ettirin.
   3. DV konumunu kaydedin. Bregma ve lambda için DV koordinatlarının 0.5 mm.
      içinde olduğundan emin olun not: Amaç, bregma ve lambda arasındaki DV farkını en aza indirmektir.
4. Hamilton şırınga iğne ucunu bregma noktasına geri döndürmek için mikromanipülatörü kullanın.
5. Başlangıç AP konumunu kaydedin.
6. Başlangıç AP koordinatından 2.00 mm çıkararak bitiş AP konumunu hesaplayın.
7. Hamilton şırınga iğnesini son AP koordinatına yeniden konumlandırmak için mikromanipülatörü kullanın.
8. Geçerli ML koordinatını kaydedin.
9. Başlangıç ML koordinatına 1,3 mm ekleyerek veya çıkararak sol ve sağ bitiş ML koordinatlarını hesaplayın.
10. Hamilton şırınga iğnesini bitiş ML koordinatlarından birine hareket ettirmek için mikromanipülatörü kullanın.
    1. İğne ucunu her iki uç ML koordinatında kafatasının yüzeyine dokundurun ve DV koordinatlarını kaydedin ve değerlerin 0,5 mm içinde olduğundan emin olun.
       NOT: Amaç, iki biten ML koordinatı arasındaki DV farkını en aza indirmektir.
    2. Bitiş koordinatındayken, iğneyi kafatasının 0,5-1 cm üzerine çekin. Kafatasının yüzeyinde bir nokta işaretlemek için steril bir ince uçlu kalem alın. Kafatasının karşı tarafı için bu adımı tekrarlayın.
11. Hamilton şırıngasını yoldan uzaklaştırın.
12. Matkaba 0.8 mm matkap kafası takın. Matkabı iki elinizle alın, stabilite için dirseklerinizi masanın yüzeyine yerleştirin ve matkap kafasını sol veya sağ ML koordinatındaki sharpie noktasının biraz üzerine yerleştirin. Matkabı etkinleştirin, kafatasında bir delik açmak için matkap ucunu kafatası yüzeyine indirin. Karşı taraf için bu adımı tekrarlayın.
    not: Yeni açılan deliklerden bir miktar kanama olabilir. Kanama varsa, kanı temizlemek için temiz ve kuru bir pamuklu çubuk kullanın.
13. Hamilton şırıngasını yeni tanıtılan ML deliklerinden herhangi birinin üzerindeki yerine geri getirin. Hamilton iğnesini kafatasının hemen yanından indirin. Bu noktada beyni delmemeye dikkat edin. İğnenin kafatasını geçtiğinden emin olmak için işaret parmağınızı alın ve iğnenin delikten çıkmadığından emin olmak için iğneyi hafifçe kafatasına doğru itin.
14. Başlangıç DV koordinatını kaydedin.
15. Başlangıç DV koordinatından 2,2 mm çıkararak bitiş DV koordinatını hesaplayın.
16. İğneyi bitiş DV koordinatına kadar indirin.
17. 4 μl Aβ1-42'yi dentat girusa 0,5 μl/dk hızında pompalamak için stereotaksik enjektör pompasını etkinleştirin.
18. İnfüzyon tamamlandığında, çözeltinin enjeksiyon bölgesinden geri akışını en aza indirmek için iğnenin 1 dakika daha yerinde kalmasına izin verin.
19. İğneyi beynin diğer tarafına getirin ve 6.13-6.18 adımlarını tekrarlayın.

7. Hayvanların Çıkarılması ve Ameliyat Sonrası Bakım

1. Kulak çubuklarını ve yüz/burun koruyucusunu sökün. Fareyi cihazdan çıkarın.
2. Kafa derisini kapatmak için öğrenci standart desenli bir forseps kullanın ve ardından yarayı bir dikişle kapatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ketamin HCl (100mg / ml)	Henry Schein Tıbbi	1049007	1 kg hayvan başına 100 mg ketamin
Ksilazin (20mg / ml)	Henry Schein Tıbbi	yok	1 kg hayvan başına 10 mg ksilazin
Aβ1-42	David Teplow / UCLA	yok	100 μM; Bu amiloid makalede kullanıldı
Aβ1-42	Bachem Belediyesi	H-1368	Teplow laboratuvarından amiloid yerine kullanılabilir
Aβ1-42	Amerikan Peptit	62-0-80B	Teplow laboratuvarından amiloid yerine kullanılabilir
Şifreli Aβ1-42	Amerikan Peptit	62-0-46B	Aβ1-42'yi karşılaştırmak için kontrol peptidi olarak kullanılabilir
GenTeal Kayganlaştırıcı Göz Jeli	Novartis Bilişim	yok	Ameliyat sırasında fare gözlerini nemli tutmak için; yerel eczanelerde bulunabilir
Refresh Optive Kayganlaştırıcı Göz Damlası	Alerji	yok	Ameliyat sırasında fare gözlerini nemli tutmak için; yerel eczanelerde bulunabilir; GenTeal yerine kullanılabilir
Betadin	Çalmak	50998	Sanitasyon ve dezenfeksiyon için
Yuvarlak/Konik Spatula	VWR (VWR)	82027-490	Hayvan ağzını açmak için
Bulldog Serrefines Kelepçeleri (Çene Kararır. 9X1.6mm; Uzunluk 28mm)	Güzel Bilim Araçları	18050-28	opsiyonel; Enjeksiyon sırasında kafa derisi derisini ayrı tutmak için
Düz İnce Makas (Kesme kenarı 25mm; Uzunluk 11,5 cm)	Güzel Bilim Araçları	14060-11	Saç derisini kesmek için
#3 Neşter Sapı	Güzel Bilim Araçları	10003-12
#11 Cerrahi Bıçak	Güzel Bilim Araçları	10011-00	Kafa derisi kesisi yapmak için
Öğrenci Standart Desen Forcep (Uç Dims. 2.5x1.5mm; Uzunluk 11,5 cm)	Güzel Bilim Araçları	91100-12	Dikiş atma sırasında kafa derisini kapalı tutmak için
Düzeltici Combo Kiti	Kent Bilimsel	CL9990-1201	Saç tıraşı için
T/Pompa Sıcak Su Sirkülatörü	Kent Bilimsel	TP-700	Ameliyat sırasında hayvanı ısıtmak için
Yeniden Kullanılabilir Savaş Madenciliği Pedi (5" x 10")	Kent Bilimsel	TPZ-0510FEA	Ameliyat sırasında hayvanı ısıtmak için T / Pompa ılık su sirkülatörüne takmak için
Akülü Mikro Matkap	Çalmak	58610	Kafatasında delikler açmak için 0,8 mm çelik çapaklar kullanın
Fare ve Yenidoğan Sıçan Adaptörlü Lab Standart Stereotaksik Alet	Çalmak	51615
Sadece Fare Stereotaksik Enstrüman İçin	Çalmak	51730	Bunu Stoelting Cat yerine kullanabilir. #51615
Özetin Özeti Stereotaksik Enjektör	Çalmak	53311
Kuru Cam Boncuk Sterilizatörü	Çalmak	50287	Paslanmaz çelik aletleri sterilize etmek için
Steril Cerrahi Örtü (18" x 26")	Çalmak	50981
Hamilton Şırınga 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL	Hamilton Şirketi	7637-01	Beyin enjeksiyonu için; farklı çözümler için farklı şırıngalar kullanın
29 Gauge İğne, Küçük Hub RN NDL	Hamilton Şirketi	7803-06	Beyin enjeksiyonu için Hamilton şırıngasına takmak için
1 ml BD Tüberkülin Şırıngaları	VWR (VWR)	BD309659	Anestezi ve salin uygulamak için
30 Gauge İğne (0,5 inç)	VWR (VWR)	BD305106	Anestezi ve salin uygulamak için
Taşınabilir Elektronik CS Serisi Kantar (Ohaus)	VWR (VWR)	65500-202	Anestezi dozunu belirlemek için hayvanları tartmak için
Sıcak plaka (Üst Plaka Dims. 7,25x7,25 inç)	VWR (VWR)	47751-148	Ameliyat sonrası hayvanları ısıtmak için
Sofsilk İpek Sütür C-1 Kesim 3/8, 12 mm	Covid (Türkçe)	S1173 Serisi	Yarayı kapatmak için
Vetbond Doku Yapıştırıcısı (3M)	Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-361931	İsteğe bağlı: yaranın kapanmasına yardımcı olmak için; Sütür ile kullanın.
Pamuk Uçlu Ahşap Milli Steril Aplikatörler	Balıkçı bilimsel	22-029-488	Cerrahi yaranın temizlenmesi ve kurutulması için
Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop Slaytları	Balıkçı Bilimsel	12-550-15	Beyin bölümlerini toplamak için
VWR Mikro Kapaklı Cam 24 X 50 mm	VWR (VWR)	48393241	Mikroskop slaytlarını monte etmek için
Thermo Scientific Nalgene Şırınga Filtresi 0.2 μm	Balıkçı Bilimsel	194-2520	Tuzlu su çözeltisini sterilize etmek için
Viscot Medikal'den steril çift uçlu cilt markörleri	Medline (Medline)	VIS1422SRL91	Kafatasındaki koordinatları işaretlemek için

Serisi Sistemleri arası numaralı telefondan takip edilmektedir. Serisi Serisi numaralı telefondan temin edilmiştir. sayılı Kanun Hükmünde Kararname Serisi