Primer Embriyonik Fare Dopamin Nöronlarında Alfa-Sinüklein Birikiminin İncelenmesi

Abstract

Kaynak: Er, S. ve ark., Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarında Önceden Oluşturulmuş Fibril İndüklenen α-Sinüklein Birikiminin İncelenmesi.J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, alfa-sinüklein önceden oluşturulmuş fibrillerle önceden tedavi edilmiş embriyonik fare dopamin nöronlarında alfa-sinüklein birikimini ölçme sürecini göstermektedir. İmmünofloresan kullanarak alfa-sinüklein agregatları içeren dopamin nöronlarını sabitleme, boyama ve nicelik belirleme adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

Protocol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Hazırlık

1. % 0.46 D-glikoz,% 1 L-glutamin,% 1 N2,% 0.2 primosin içeren dopamin nöron ortamı (DPM) hazırlayın, DMEM / F12 ile tamamlayın. Malzemeleri karıştırdıktan sonra DPM'yi filtreleyin. DPM'yi 4 °C'de saklayın ve her bir alikotu yalnızca bir kez ısıtın.
   not: DPM, dopamin nöronlarında α-sinüklein birikimini azaltacağı için glia kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) içermemelidir.
2. Son derece hidrofobik olan silikonlu cam pipetler hazırlayın, böylece embriyonik nöronların ilk kullanımı sırasında yüzeye yapışmayı ve hücre kaybını en aza indirin.
   1. 1 L damıtılmış suya 10 mL silikonlama sıvısı ekleyin ve 2 L'lik bir kapta karıştırarak karıştırın. Cam pipetleri 15 dakika silikonlama solüsyonuna batırılmış halde bırakın.
   2. Pipetleri 3-5x damıtılmış suyla durulayın. Kurutmayı hızlandırmak için pipetleri gece boyunca oda sıcaklığında (RT) veya 100-120 °C ısıtılmış steril alanda 1-2 saat kurutun.
   3. Pipetleri kapalı bir otoklav torbasında standart otoklavlama ile sterilize edin.
3. Nöronların tohumlanması için kullanılacak 96 oyuklu plakanın orta kuyucuklarına 60 μL PO çözeltisi ekleyerek, kenar etkilerini önlemek için plakanın kenarlarında en az bir sıra / sütun kuyucuk bırakarak şeffaf tabanlı poli-L-ornitin (PO) kaplı 96 kuyulu plakalar hazırlayın. Kaplanmış plakayı gece boyunca 4 °C'de veya RT'de 4 saat tutun.
4. Hücreleri kaplamadan önce, PO'yu tamamen aspire edin ve hücreleri 100 μL 1x Fosfat Tampon Salin (PBS) ile üç kez yıkayın. Kuyucuklardan 1x PBS aspire edin ve tam kurutma için plakanın kapağını açık tutun.
   not: Kullanılmış PO'yu toplamak ve yeniden kullanım için filtrelemek mümkündür. Bu, aynı PO çözeltisi için iki kez tekrarlanabilir.
5. Önceden kaplanmış kuyucuklara 50 μL DPM ekleyin. DPM'yi kuyucuklardan 100 μL'lik bir plastik uçla aspire edin ve aynı anda her bir kuyunun çevresindeki kaplamayı çıkarmak için kuyunun tabanını dairesel hareketlerle çizin. Kuyunun ortasında PO kaplı bir ada kalacaktır.
6. Laminer bir başlık altında, mikro adalar oluşturmak için kaplanmış her adanın ortasına 10 μL DPM ekleyin.
   not: DPM kaplı mikro adalara sahip bir plaka, hücrelerin izolasyonu sırasında 1-2 saat boyunca laminer akış başlığının altında tutulabilir.

2. E13.5 fare embriyolarından ventral orta beyin tabanının izolasyonu

NOT: Orta beyin tabanı diseksiyon adımları için Şekil 1'e bakın.

1. Diseksiyondan önce, 10 cm'lik bir Petri kabını Dulbecco'nun tamponu ile doldurun ve buz üzerinde tutun.
2. Kurumun yönergelerine göre bir E13.5 hamile dişi fareye ötenazi yapın. Fareyi sırt üstü düz bir şekilde yerleştirin ve ön gövdeye %70 etanol püskürtün. Forseps ile rahim üzerindeki cildi kaldırın ve uterusu ortaya çıkarmak için cerrahi makasla bir kesi yapın.
3. Rahmi dikkatlice çıkarın ve önceden hazırlanmış Petri kabına buz üzerine yerleştirin.
4. RT'de laminer kaputun altında cerrahi makas kullanarak, embriyoları uterustan dikkatlice çıkarın. Embriyolardaki tüm plasenta kalıntılarını forseps ile çıkarın ve bunları Dulbecco'nun tamponu ile doldurulmuş 10 cm'lik yeni bir Petri kabına yerleştirin.
5. Diseksiyon forseps veya iğneleri kullanarak, Şekil 1A'da siyah oklarla işaretlenmiş yerlerden başın arka kısmını kesin. Kesilen parçayı embriyonun geri kalanından uzaklaştırın (Şekil 1B).
6. Kesilen parçanın arka tarafını gözlemciye doğru yerleştirin (Şekil 1C) ve kaudalden kraniyal doğruya doğru yavaşça kesin (Şekil 1D). Kraniyal açıklığın 0,5 mm altından, Şekil 2E'de gösterilen 3 mm²–2 mm¹ bölgeyi kesin.
7. Ventral orta beyin tabanını (bkz. Şekil 1F) 1.5 mL'lik boş bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Mikrosantrifüj tüpünü, tüm orta beyin tabanları içinde toplanana kadar buz üzerinde tutun.
   not: Alternatif olarak, tüm embriyo beyinlerinin diseksiyonundan sonra orta beyin tabanları 1 mL'lik bir mikropipet ile toplanabilir.

3. E13.5 fare embriyolarından 96 oyuklu plaka formatında birincil embriyonik orta beyin kültürlerinin oluşturulması

1. Aynı 1.5 mL'lik tüpteki tüm embriyolardan orta beyin tabanlarının toplanmasından sonra, kalan Dulbecco'nun tamponunu çıkarın ve doku parçalarını 500 μL Ca^{2 +}, Mg^{2 +} içermeyen Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile üç kez yıkayın.
2. HBSS'yi çıkarın ve tüpe 500 μL% 0.5 tripsin ekleyin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
3. İnkübasyon sırasında, 1.5 mL fetal sığır serumunu (FBS) 37 ° C'de ısıtın, FBS'ye 30 μL DNaz I ekleyin ve karıştırın. Ayrıca, silikonlu bir cam pipetin ucunu ateşle parlatın. Deliğin keskin kenarları olmadığından ve 1 mL mikropipet ucuyla yaklaşık aynı boyutta olduğundan emin olun.
   NOT: Alternatif olarak, öğütme için düşük yapışma özelliğine sahip 1 mL mikropipet ucu kullanılabilir. Bununla birlikte, silikonlu cam pipetler en iyi sonuçları veriyor gibi görünmektedir.
4. Adım 3.2'deki inkübasyon biter bitmez, kısmen sindirilmiş dokuya 500 μL FBS/DNaz karışımı ekleyin. FBS/tripsin karışımındaki dokuyu ezmek için cam pipeti kullanın. Dokular küçük, zar zor görülebilen parçacıklara ayrılana kadar tritüre edin. Öğütme sırasında kabarcıklardan kaçının.
5. Kalan parçacıkların yerçekimi ile mikrosantrifüj tüpünün dibinde çökelmesine izin verin. Alttaki çökeltiyi pipetlemeden, süpernatanı 15 mL'lik boş bir konik polipropilen tüpe toplayın.
6. FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) elde etmek için FBS/DNase I'i adım 3.3'ten (98:2) 1.000 μL HBSS ile seyreltin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Mikrosantrifüj tüpünde kalan parçacıklara 1.000 μL yeni karışım ekleyin. Tekrar ezin ve adım 3.5'i tekrarlayın.
7. Tüm FBS/DNASE-I/HBSS'yi (49:1:50) kullanmak için önceki adımı bir kez daha tekrarlayın.
8. Tüm süpernatant 15 mL'lik tüpün içinde toplandıktan sonra (3.5, 3.7 ve 3.8. adımlardan), süpernatanı (~ 3 mL) 5 dakika boyunca 100 x g'da döndürmek için bir masa üstü santrifüj kullanın. Alttaki peletlenmiş hücrelere dokunmadan süpernatanı çıkarın.
9. Tüpe 2 mL DPM ekleyerek hücre peletini yıkayın ve 5 dakika boyunca 100 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın ve peletlenmiş hücrelerdeki kalıntıları en aza indirmek için yıkamayı 2 kez tekrarlayın.
   NOT: Kültürlenmiş nöronlar için her zaman taze, ısıtılmış DPM kullanın. Yıkama adımları için DPM'nin taze olması gerekmez, ancak 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmalıdır.
10. Hücreleri taze, ılık DPM ile seyreltin ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Seyreltme için DPM miktarı, doku diseksiyonu için kullanılan embriyo sayısına bağlıdır. Örneğin, on embriyodan elde edilen hücreleri seyreltmek için 150 μL DPM kullanın.
11. DPM'deki 10 μL hücreyi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bunları 10 μL% 0.4 Tripan mavisi lekesi ile karıştırın. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak canlı (yani Tripan mavisi negatif) hücreleri sayın.
    NOT: Kuyucuk başına ~ 1.000 dopamin nöronu elde etmek için oyuk başına kaplama için 30.000 hücre kullanın. Hücre yoğunluğu 6 μL'de ~ 30.000 hücreden yüksekse, tohumlama hacmi 6 μL'den az olmayacak şekilde kaplamadan önce hücreleri DPM ile daha da seyreltin.
12. Kuyuların dibine dokunmadan, DPM'yi adım 1.6'da oluşturulan mikro adalardan çıkarın.
13. Her bir oyukta tekrarlanabilir hücre yoğunluğu elde etmek için, kuyucukta kaplamadan önce hücreleri nazikçe pipetleyerek karıştırın. 1-10 μL'lik bir mikropipet ile, her bir eski mikro adanın bulunduğu kuyunun ortasına 6 μL hücre ekleyin.
14. Nöronal kültürler içeren kuyucuklardan buharlaşmayı en aza indirmek için plakanın kenarlarındaki boş kuyuları 150 μL su veya 1x PBS ile doldurun. Plakayı bir inkübatörde 37 °C'de,% 5 CO₂ 1 saat inkübe edin.
15. 1 saat sonra, plakayı inkübatörden çıkarın, hücrelerle birlikte her bir oyuğa 100 μL DPM ekleyin ve inkübatöre geri yerleştirin.
16. Kaplamadan iki gün sonra (in vitro 2 veya DIV2 günü), 25 μL'yi çıkarın ve nihai ortam hacmini 150 μL'ye getirmek ve buharlaşmayı mümkün olduğunca önlemek için 75 μL taze DPM ekleyin.
17. DIV5'te ortamın yarısını taze DPM ile değiştirin (yani, 75 μL'yi çıkarın ve 75 μL taze DPM ekleyin). DIV5'ten sonra herhangi bir medya değişikliği yapmayın.

4. Primer embriyonik dopamin nöronlarında α-sinüklein agregatlarının önceden oluşturulmuş fibrillerle tohumlama yoluyla indüksiyonu

α-sinüklein önceden oluşturulmuş fibriller (PFF'ler) ile yapılan herhangi bir çalışmanın ardından, laminer başlığı veya PFF'lerle temas etmiş olabilecek herhangi bir ekipmanı %1 Sodyum dodesil sülfat (SDS) ve ardından %70 etanol ile temizleyin.

1. Deneyden önce, PFF'leri 1x PBS ile 100 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Seyreltilmiş PFF'leri mikrosantrifüj tüplerinde bir banyo sonikatörü ile 10 döngü için 4 ° C'de su banyosu soğutması ile yüksek güçte bir banyo sonikatörü ile sonikasyon, 30 s AÇIK / 30 s KAPALI
   not: Fibrillerin ~ 50 nm uzunluğunda parçalar oluşturmak için uygun şekilde sonikleştirilmesi çok önemlidir. Sonikasyonlu PFF'lerin boyutu, lekeli PFF'lerin transmisyon elektron mikroskobu görüntülerinden doğrudan ölçülebilir. Sonikasyon, yüksek güçlü bir banyo sonikatöründe yukarıda açıklandığı gibi elde edilebilir. Alternatif olarak, bir uç sonikatörü kullanılabilir. Sonikasyonlu PFF'ler, çoklu donma / çözülme döngülerini önlemek için küçük alikotlarda -80 ° C'de saklanabilir.
2. DIV8'de, kuyucuktaki 150 μL ortama oyuk başına 3.75 μL 100 μg/mL PFF ekleyin ve 2.5 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Kontrol grubu için aynı miktarda 1x PBS kullanın.
3. 1x PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın ve alikotları -20 °C'de saklayın. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
   NOT: PFA toksiktir; hazırlık sırasında maske ve eldiven giyin, her zaman laminer başlık altında çalışın ve tüm katı ve sıvı PFA atıklarını kurumun talimatlarına göre atın.
   1. 1 L'lik bir kapta 500 mL 1x PBS'yi ısıtın. Kabın içine bir karıştırma çubuğu koyun ve kabı ısıtma fonksiyonlu manyetik bir karıştırıcıya koyun. Çözeltiyi sıcak tutarken kaynamayı önlemek için sıcaklığı 40–60 °C arasında ayarlayın.
   2. Tek kullanımlık plastik bir ölçüm kabında kaputun altında 20 g PFA tozu ölçün. PFA tozunu 1x PBS ile doldurulmuş kaba dikkatlice ekleyin. Çözeltiyi karıştırmaya başlayın.
   3. Çözeltiye 200 μL 5 M sodyum hidroksit ekleyin ve PFA tamamen eriyene kadar ~15 dakika karıştırmaya devam edin.
   4. Çözelti homojen göründükten sonra, pH'ı ~7'ye dengelemek için 168 μL 5 M hidrojen klorür ekleyin. Tek kullanımlık renkte sabitlenmiş pH indikatör şeritleri ile pH'ı kontrol edin.
   5. Kabı ısıtıcıdan çıkarın ve RT'ye soğumasını bekleyin. -20 ° C'de saklamak için çözeltiyi ve alikotu filtreleyin. Kullanmadan önce alikotları RT'de çözün ve daha sonra tekrar dondurmayın.
4. DIV15'te, pipetleme yoluyla tüm ortamları kuyulardan çıkarın. Hücreleri sabitlemek için her bir oyuğa 50 μL% 4 PFA ekleyin ve RT'de 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PFA'yı kuyucuklardan çıkarın ve hücreleri yıkamak için her oyuğa 100 μL 1x PBS ekleyin. 1x PBS'yi çıkarın ve 2x daha yıkayın.
5. Kurumasını önlemek için her kuyucukta 100 μL 1x PBS bırakın. İmmünokimya yapılana kadar plakayı 4 °C'de saklayın.

5. 96 oyuklu plakada primer embriyonik dopamin nöronlarının immünofloresan boyama ve otomatik görüntülenmesi

1. 1x PBS'yi çıkarın ve kuyucuk başına PBS'ye (PBST) 100 μL% 0.2 Triton X-100 ekleyerek ve RT'de 15 dakika inkübe ederek hücreleri geçirgen hale getirin.
2. PBST'yi çıkarın ve PBST'ye oyuk başına 50 μL% 5 normal at serumu (NHS) ekleyin. Spesifik olmayan antijen aktivitesini bloke etmek için, RT'de 1 saat inkübe edin.
3. PBST'de% 5 NHS'de tirozin hidroksilaz (TH) ve pS129-αsyn'e (1: 2.000) karşı birincil antikorları seyreltin. Her oyuğa 50 μL seyreltilmiş antikor ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
4. Antikorları çıkarın ve hücreleri yıkamak için her oyuğa 100 μL 1x PBS ekleyin. 1x PBS'yi çıkarın ve 2x yıkamayı tekrarlayın.
5. Floresan moleküllerinin ağarmasını önlemek için, minimum ışık koşullarında çalışmaya başlayın. İkincil floresan işaretli antikorları (1:400) PBST'de seyreltin. Her oyuğa 50 μL seyreltilmiş antikor ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin.
6. Antikor çözeltisini çıkarın ve hücreleri yıkamak için her bir oyuğa 100 μL 1x PBS ekleyin. 1x PBS'yi çıkarın ve 2x yıkamayı tekrarlayın.
7. 1x PBS'yi çıkarın, kültürlenmiş hücrelerin çekirdeklerini boyamak için oyuk başına 50 μL 200 ng / mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
8. Hücreleri 3x 100 μL 1x PBS ile her biri 5 dakika boyunca yıkayın. Son yıkamadan sonra her kuyucukta 100 μL 1x PBS bulundurun. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve görüntü oluşana kadar 4 °C'de saklayın.
9. Birincil embriyonik dopamin nöronlarını, 10x objektif ile donatılmış yüksek içerikli bir plaka tarayıcı (Malzeme Tablosuna bakınız) ile 96 kuyulu bir görünüm plakasında görüntüleyin.
10. Ayarları, plaka tipi, üretici, boyut, kuyular arasındaki mesafe ve ayrıca ortamın türü ve miktarı gibi 96 kuyulu plakanın özelliklerine göre ayarlayın.
11. Bir mikro adadaki tüm hücreleri kaplamak için kuyunun görüntüleme alanını seçin. Otomatik odaklamayı ayarlamak için bir örnek kuyu seçin. İlk odağı DAPI'ye dayandırın.
12. Kontrol kuyularındaki lekelenmenin yoğunluğuna bağlı olarak her bir floresan kanalı için alım süresini kalibre edin. Parametreleri, PFF ile muamele edilen kontrol kuyularında, hücre somasında pS129-αsyn agregatlarını barındıran dopamin hücrelerinin açıkça ayırt edilebilmesi için ayarlayın, bu da pS129-αsyn pozitif ve pS129-αsyn negatif hücrelerin kesin olarak ölçülmesine izin verir.
    not: PFF içermeyen kuyucuklarda pS129-αsyn için herhangi bir boyama olmamalıdır; bu nedenle, bu kuyular pS129-αsyn yoğunluğunu ayarlamak için negatif kontrol olarak kullanılabilir.
13. Seçilen tüm kuyucukları, tamamen aynı parametrelerle immünofloresan boyamalı tüm kanallar için aynı anda 10x objektifle görüntüleyin.
14. İsteğe bağlı olarak, pS129-αsyn-pozitif inklüzyonların sayısındaki değişikliklerin, fosforilasyonun inhibisyonu veya pS129-αsyn'in defosforilasyonu yerine protein birikimindeki azalmayı yansıttığını doğrulamak için oyukların bir alt kümesindeki α α-sinüklein inklüzyonları filamentli -sinüklein bir alt kümesinde etiketleyin.
15. pS129-αsyn antikorunu α-sinüklein filament antikoru (1:2.000) ile değiştirerek 5.3. adımı tekrarlayın. Lekeli toplanmış α-sinükleini adım 5.13'teki gibi görüntüleyin.

Results

Şekil 1: E13.5 fare embriyosundan orta beyin tabanının diseksiyonu. (A) Başın arka kısmındaki kesme yerleri siyah oklar ve beyaz kesikli çizgilerle işaretlenmiştir. (B) Parça, embriyonun geri kalanından çıkarıldı. Çıkarılan parça daire içine alınır. (C) Parça, arka tarafı gözlemciye bakacak şekilde 90° döndürüldü. (D) Parça siyah okla...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
% 0.4 Tripan Mavi leke	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	15250061
15 ml CELLSTAR Polipropilen tüp	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Almanya	188261
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	10236276001
5 milyon HCl	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
5 M NaOH	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
96 kuyulu ViewPlate (Siyah)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Amerika Birleşik Devletleri	6005182
%99,5 Etanol (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlandiya	Yok
AquaSil Silikonlaştırıcı Sıvı	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	TS-42799
Otoklavlanmış 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
Bioruptor sonikasyon cihazı	Diagenode, Liege, Belçika	B01020001
Ca2+, Mg2+ içermeyen Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	14175-053
CellProfiler ve CellAnalyst yazılım paketleri	Yok	Yok	Ücretsiz açık kaynaklı yazılım
Santrifüj 5702	Eppendorf AG, Hamburg, Almanya	5702000019
CO2 İnkübatörü	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	Yok
Sayma odası	BioRad Inc., Herkül, Kaliforniya, ABD	1450015
DeltaVision Ultra Yüksek Çözünürlüklü Mikroskop, hava tablalı ve kabinli	GE Sağlık Yaşam Bilimleri, Boston, Massachusetts, ABD	29254706
Deoksiribonükleaz-I (Dnase I)	Roche, Basel, İsviçre	22098700
D-glikoz	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	G8769
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	21331-020
eşek anti-fare AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	A21202
eşek anti-tavşan AlexaFluor 647	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	A31573
eşek anti-koyun AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	A11015
Dulbecco'nun tamponu	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	10500056
Fisherbrand Düz Ekonomi PTFE Karıştırma Çubuğu	balıkçı bilimsel, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	11507582
ImageXpress Nano Otomatik Görüntüleme Sistemi	Moleküler Cihazlar, San Jose, Kaliforniya, ABD	Yok
L-glutamin	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	25030-032
fare monoklonal anti-tirozin hidroksilaz	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Almanca	MAB318
N2 takviyesi	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	17502-048
Normal At Serumu	Vector Laboratories Inc., Burlingame, Kaliforniya, Amerika Birleşik Devletleri	S-2000 Zırhlı Uçak Gemisi
paraformaldehit (PFA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	158127
Paraformaldehit tozu, %95	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	158127
pH-Fix, renk sabit gösterge şeritleri	Macherey-Nagel, Düren, Almanya	92110
Fosfohat: Tampon Salin (PBS)	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
poli-L-ornitin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	P4957 Serisi
Çuha çiçeği	InvivoGen, San Diego, Kaliforniya, ABD	KARINCA PM-1, KARINCA PM-2
tavşan monoklonal anti-alfa-sinüklein filamenti	Abcam, Cambridge, Birleşik Krallık	ab209538
tavşan monoklonal anti-fosfat-serin129-alfa-sinüklein	Abcam, Cambridge, Birleşik Krallık	AB51253
RCT Basic, IKA Manyetik Karıştırıcı	IKA-Werke® GmbH, Staufen, Almanya	3810000
rekombinant insan glia kaynaklı nörotrofik faktör (hGDNF)	PeproTech, Rocky Hill, NJ, ABD veya Prospec, Ness-Ziona, İsrail	450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
rekombinant fare alfa sinüklein Önceden Şekillendirilmiş Fibriller (PFF'ler)	Yok	Yok	İşbirlikçisi Prof. Kelvin C Luk'tan hediye
Araştırma Stereomikroskop Sistemi	Olympus Corporation, Tokyo, Japonya	SZX10
Koyun Poliklonal Anti-tirozin hidroksilaz	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Almanca	AB1542
TC 20 Otomatik Hücre Sayacı	BioRad Inc., Herkül, Kaliforniya, ABD	1450102
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	11332481001
tripsin	MP Biyomedikal, Valiant Co., Yantai, Shandong, Çin	2199700