Method Article

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

DOI:

10.3791/3140

October 7th, 2011

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bir model herpes, gamma herpes 68 (γHV68) litik çoğaltma konak sinyal molekülleri arasında önemli rolleri tanımlamak için bir protokol açıklar. Genetiği değiştirilmiş fare suşları ve γHV68 litik replikasyon için embriyonik fibroblastlar kullanarak, protokol fenotipik karakterizasyonu ve viral litik çoğaltma virüs konak etkileşimler moleküler sorgulama hem de izin verir.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viral enfeksiyon yanıt olarak, bir dizi gibi antiviral sitokin üretimini 1,2 yol doğuştan gelen bağışıklık sinyal yolakları aktive gibi çeşitli savunma yanıtları, geliştirir. Ana koloni için, virüs konak antiviral yanıtları kaçmasına ve sinyal yolları işlemek için zorunlu bulunmaktadır. Konak-virüs etkileşimi unraveling viral enfeksiyona karşı yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi ışık tutacaktır.

Mürin γHV68 yakından insan onkojenik Kaposi sarkomu-ilişkili herpes ve Epsten-Barr virüsü 3,4 ilişkilidir. laboratuvar farelerde γHV68 enfeksiyonu insan herpesvirüslerinin için mevcut değildir vivo, konak yanıtları ve viral enfeksiyon tüm kurs incelemek için uysal küçük bir hayvan modeli sağlar. Bu protokol, biz γHV68 litik replic bir fenotipik karakterizasyon yöntemleri paneli ve ana sinyal bileşenlerinin moleküler diseksiyonu sunmakvivo ve ex vivo hem ation. Genetiği değiştirilmiş fare suşlarının durumu vivo γHV68 akut enfeksiyon sırasında ana sinyal yollarının rolleri sorgulamaya izin verir. Buna ek olarak, bu eksik fare suşu izole edilmiş fare embriyo fibroblast (MEFS) ileri γHV68 litik çoğaltma ex vivo sırasında bu moleküllerin rolleri incelemek için kullanılabilir.

Virolojik ve moleküler biyoloji deneyleri kullanarak, konak-virüs etkileşimlerinin moleküler mekanizması kesin ve viral litik replikasyon için gerekli ana ve viral genleri tespit edebilirsiniz. Son olarak, bakteriyel suni bir kromozom (BAC) sistemi özellikle ev sahibi-virüs etkileşim kesme viral faktör (ler) içine mutasyonların girişini kolaylaştırır. Bu mutasyonlar taşıyan rekombinant γHV68 bileşenleri sinyal anahtar konak içinde eksik MEFS içinde γHV68 litik çoğaltma fenotipleri tekrarlamak için de kullanılabilir.Bu protokol vivo ve ex vivo müdahale birden çok düzeyde konak-patojen etkileşimi sorgulamak için mükemmel bir strateji sunar.

Son zamanlarda, biz γHV68 usurps doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyon yolağı viral litik replikasyon 5 teşvik etmek olduğunu keşfettiler. Özellikle, γHV68 de novo enfeksiyonu bağışıklık kinaz IKKβ aktive Olmanız IKKβ viral transkripsiyonel aktivasyon teşvik etmek, ana viral transkripsiyon faktörü, çoğaltma ve Transaktivatörü (RTA) fosforile. Bunu yaparken, γHV68 verimli çiftler doğal immün aktivasyon ev sahipliği için transkripsiyonel aktivasyon, böylece viral transkripsiyon ve litik replikasyon kolaylaştırmak. Bu çalışmada ana-virüs etkileşimi sorgulamak diğer virüsler uygulanabilir mükemmel bir örnek sağlar.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ΓHV68 ile Fare enfeksiyonu

  1. Altı-sekiz haftalık, cinsiyet açısından Kardeş fareler (8 ila 12 fare / grup) viral enfeksiyon için kullanılır. Fareler sevkiyat sonra dört tam gün (96 saat) boyunca gelmesini bekleyin.
  2. Virüs kullanarak Protokol adımları standart BSL2'ye önlemler kullanılarak biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL-2) bir kabin içinde yapılmalıdır.
  3. Sadece deneme önce fare başına steril PBS 30 ul γHV68 (40 1 x 10 5 plak oluşturan birim [PFU]) viral süspansiyonu hazırlayın. Buz üzerinde viral süspansiyon tutun.
  4. Fare sedasyon için ketamin / xylazine çözeltisi (1.5 mg ketamin ve 0.15 mg xylazine/20 g vücut ağırlığı, 100....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viral enfeksiyon yanıt olarak, Mavs-bağımlı doğuştan gelen bağışıklık sinyal yollarının antiviral 10-14 enflamatuvar sitokinlerin üretimini teşvik etmek için aktif hale getirilir. İnsan onkojenik Kaposi sarkomu-ilişkili herpes ve Epstein-Barr virüsü 3,4 için model virüs olarak mürin γHV68 kullanarak, γHV68 usurps Mavs-IKKβ yolu transkripsiyonel aktivasyonu 5 ile viral litik replikasyon teşvik etmek olduğunu keşfetti. Genetiği değiştirilmiş MEFS ve moleküler viroloji teknikleri uygulamak .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Dr James (Zhijian) teşekkür etmek istiyorum Mavs içeren esansiyel reaktifleri, sağlamak için Chen (Güneybatı UT, Moleküler Biyoloji) - / - fareler ve Dr Ren Sun (California-Los Angeles Üniversitesi, Farmakoloji ve Moleküler Tıp ) bu çalışma için γHV68 bakteriyel yapay kromozom sağlamak için.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası
Lipofektamin 2000 Invitrogen 11668-019
Elektro-MAX DH10B yetenekli hücrelerin Invitrogen 18290-015
Metilselüloz Sigma M0512
POWERPREP HP Plazmid Miniprep Sistemi OriGene NP100004
POWERPREP HP Plazmid Midiprep Sistemi OriGene NP100006

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
  2. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449, 819-826 (2007).
  3. Speck, S. H., Virgin, H. W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Herpesvirus Lytic ReplicationHost virus InteractionGamma HV68Mavs Knockout MiceMouse Embryonic FibroblastsPlaque AssayReal time PCRViral Titer MeasurementInnate Immune SignalingBacterial Artificial Chromosome

Related Articles