İnsan Periferik Kanından Trombositten Zengin Plazma Hazırlanması

Özet

Bu video, trombosit sayımı taraması, kanın toplanması ve santrifüjlenmesi ve trombositlerin izole edilmesi yoluyla yüksek kaliteli Trombositten Zengin Plazmanın (PRP) hazırlanmasını göstermektedir. Bu PRP, doku yenilenmesi ve iyileşmesi için terapötik uygulamalarda kullanılır.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Örnek koleksiyonu

1. trombositopeniyi ekarte etmek ve başlangıç hücre sayımlarını belirlemek için ön kan sayımlarını kullanarak hastaları tarayın. Bunu yapmak için, hücre sayımı için klinik dereceli bir hemositometre kullanın. Trombosit sayılarının 150.000 hücre / μL'nin üzerinde olduğundan emin olun.

2. Numune almadan önce hastanın iyice su içtiğinden emin olun. Bu, dilin görsel muayenesi, cilt turgoru ve kan basıncı ölçümü ile sağlanabilir.

3. 1:10 oranında 5 mL Asit-Sitrat-Dekstroz-Adenin (ACDA) antikoagülanı ile doldurulmuş 2 x 50 mL şırınga kullanarak hastanın antekübital veninden 100 mL periferik venöz kan toplayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kan örneğinin pıhtılaşmasını önlemek için antikoagülanın uygun şekilde karıştırılması için toplanan şırıngaları eğin.
   NOT: Yavaş kan alımı, toplanan kanın antikoagülanla yetersiz karışmasına ve pıhtılaşmaya neden olabilir; bu nedenle, kan alımı için en az 18G kanül kullanın.

4. Şırıngalardaki 100 mL kanı, her tüpte 10 mL olacak şekilde 15 mL konik tabanlı santrifüj tüplerine aktarın.

2. Santrifüjleme ve izolasyon

1. Santrifüj tüplerini steril bir ortamda oda sıcaklığında tutulan klinik dereceli bir masa üstü santrifüj makinesine yerleştirin ve ilk yumuşak dönüşü 100 x g hızında çalıştırın 15 dk. Antikoagüle kan üç katmana ayrılır, yani altta kırmızı kan hücreleri, üstte plazma ve ortada buffy ceket.

2. Üç katmanlı numunenin üst katmanını 18G steril spinal iğne kullanarak steril bir şekilde pipetleyin ve ayrı bir konik tabanlı santrifüj tüpünde toplayın. Toplanan her 10 mL plazma için ayrı tüpler olduğundan emin olun.
   NOT: Buffy kaplamayı dahil etme kararı, izole etmeye çalıştığımız trombositten zengin plazmanın doğasına bağlıdır ve bu da klinik uygulamasının doğasına bağlıdır. Lökositten fakir PRP istenen ürünse, buffy coat tabakasını dahil etmekten kaçının, oysa lökosit açısından zengin PRP istenen ürün ise, buffy coat ile birlikte üst plazma tabakası ikinci tur santrifüjleme için pipetlenir.

3. Toplanan plazmayı, her biri 10 mL plazma içeren 15 mL santrifüj tüplerinde 20 dakika boyunca 1600 x g'da sert spin santrifüjlemeye tabi tutun. Test tüpünün altındaki plazma peletinde bulunan trombositler. Süpernatanı ayrı bir tüpte toplayın.

4. Trombosit peletini 18 G steril spinal iğne yardımıyla 5 mL'lik bir şırıngaya pipetleyin. Uygulama için tüm test tüplerini peletli tek bir 5 mL şırıngada toplayın.

5. İkinci santrifüj turunu takiben santrifüjleme tüpündeki süpernatan plazma ile toplanan peleti klinik kullanım için yeterli hacimlerle sulandırın.

3. Validation

1. Trombosit sayısını hesaplamak ve PRP'deki mutlak trombosit sayısını, taban çizgisi üzerinde elde edilen trombosit konsantrasyon gradyanını ve aşağıdaki formülü kullanarak protokolün trombosit geri kazanım etkinliğini hesaplamak için klinik dereceli hemasitometre kullanılarak hazırlanan son PRP'yi hücre sayımına tabi tutun.
   Mutlak Trombosit Sayısı = μL cinsinden PRP'nin trombosit sayısı x 1000 x mL cinsinden PRP hacmi
   Trombosit konsantrasyon gradyanı = <
   span style="color:black;">Trombosit geri kazanım verimliliği =
   Örneğin, PRP hazırlanması için başlangıç trombosit sayısı 200.000 / μL olan 100 mL kan kullanılır ve son trombosit sayısı 3.000.000 / μL olan 5 mL PRP elde edilir. Yukarıda belirtilen parametreler şu şekilde hesaplanır:
   Mutlak Trombosit Sayısı = 3.000.000 x 1000 x 5 = 15 milyar platelets
   Trombosit konsantrasyon gradyanı = 3.000.000 / 200.000 = 15
   Trombosit geri kazanım verimliliği = 3.000.000 x 1000 x 5 / 200.000 x 1000 x 100 = u

2. Tekrarlanan döngüler yoluyla protokolün kurtarma verimliliğini sağlayın. Kullanılan etkili bir protokol, %>80 geri kazanım verimliliği ile taban çizgisinin 5 katının üzerinde bir konsantrasyon gradyanı sağlar. PRP hacminin istenen kullanımına bağlı olarak, verilmesi gereken trombosit sayıları buna göre titre edilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Antikoagülan Sitrat Dekstroz Solüsyonu IP	Fresenius Kabi, Hindistan	ACDAIP/L/A/19/00
BD Quincke Needle	Becton Dickinson, İspanya	405125	18G
DISPOVAN 50ml şırınga	Hindustan Şırıngalar ve Tıbbi Cihazlar Ltd, Hindistan
DISPOVAN 5ml şırınga	Hindustan Şırıngalar ve Tıbbi Cihazlar Ltd, Hindistan
Spinwin Tüp Konik Alt	Tarsons, Hindistan	546021
Sysmex XN-350	Sysmex Inc., USA	XN 350
Masa Üstü Klinik Santrifüj Makinesi	REMI, Hindistan	R-8C	4x4 kuyu açılır rotor