Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

Summary

Fluorofor geliştirme ve görüntüleme teknolojisi, virüs, virüs ve hücre arasındaki ilk etkileşimleri görselleştirmek için geliştirildi dang Alexa Fluor etiketleme basit bir yöntem gelişmeler yararlanan.

Abstract

Virüs ve hücre arasındaki etkileşimin erken olaylar enfeksiyon sonucu üzerinde derin bir etkiye sahip olabilir. Bu etkileşimin etkileyen faktörlerin belirlenmesi, hastalık patogenezi daha iyi anlaşılması için yol ve böylece aşı veya tedavi edici tasarımı etkileyebilir. Bu nedenle, bu etkileşimin prob yöntemlerin geliştirilmesi yararlı olacaktır. Fluorophores geliştirme ^1-3 ve görüntüleme teknolojisi ^4, son gelişmeler, dang patogenezi ile ilgili mevcut bilgi geliştirmek ve böylece milyonlarca yılda meydana gelen dang enfeksiyonları azaltmak için önünü yararlanılabilir.

Zarflı Dang virüsü tek bir pozitif iplikli RNA genomu ⁵ içeren nucleocapsid kabuk korunması, 90 zarf glikoprotein (E) dimerleri oluşan harici bir iskele vardır. Böylece virüsün yüzeyinde aynı protein altbirimden amin reaktif boya ile etiketlenmiş ve immunofluorescent mikroskobu yoluyla görüntülendi olabilir. Burada, Alexa Fluor succinimidyl ester boya etiketleme sonra, son derece canlı virüs vermiştir sodyum bikarbonat tampon doğrudan çözünmüş dang virüsü etiketleme basit bir yöntem mevcut. Canlı virüs ve protein etiketleme genellikle dimetil sülfoksit boya sulandırılması gereklidir mevcut üretici protokol etiketlenmesi için standart bir prosedür yoktur. Varlığı, dimetil sülfoksit dakika miktarlarda bile, virüs verimli enfeksiyonu engellemek ve aynı zamanda hücre sitotoksik ⁶ neden. Bu protokol dimetil sülfoksit kullanımı dışlama böylece bu olasılığı azalır. Alexa Fluor boyalar üstün fotostabilite ve hücresel alımı ve virüs endosomal taşıma çalışmaları için ideal hale getirir, floresein ve ^rodamin 2 olarak ortak boyalar, daha az pH duyarlı . Alexa Fluor boya konjugasyon virüs spesifik antikor ve konak hücrelerine ⁷ varsayılan reseptörleri etiketli Dang virüsü tanıma etkilemedi. Bu yöntem, virolojik çalışmalarda faydalı uygulamalar olabilir.

Protocol

1. Dang virüsü Alexa Fluor etiketleme

1. Etiketleme reaksiyon önce, sakaroz yastık dang virüs arındırmak ve protokolde belirtilen gerekli reaktifler ve ekipman hazırlamak.
2. Etiketleme ve filtre 0.2μm şırınga filtreler ile sterilize hemen önce taze 0,2 M sodyum bikarbonat tamponu, pH 8.5 (etiketleme tampon), ve 1,5 M hidroksilamin tamponu, pH 8.3 (reaktif durdurmak) hazırlayın.
3. 1ml 2ml tüp tampon etiketleme saflaştırılmış dang virüsü yaklaşık 3x10 ⁸ plak oluşturan birim (pfu) sulandırınız. Bu virüs toplu etiketleme için orantılı büyütülüyor olabilir.
4. Sulandırın liyofilize Alexa Fluor 594 (AF594) hemen önce etiketleme rea....

Discussion

Bu raporda AF594 boya kullanılmış olmasına rağmen, Alexa Fluor succinimidyl esterleri serisi fluorophores geniş bir yelpazede benzer etiketleme kimyası ile kullanılabilir. Bu etiketleme uygulaması görüntüleme ötesinde genişletmek olabilir. Flow sitometri, heyecanlı ve FACS makine ile tespit edilebilir fluorophores etiketleme derecesini tahmin etmek için konfokal mikroskopi bir alternatif olarak kullanılabilir.

Alexa Fluor boyalar, serbest amino grupları, öncelikle arginin ve ^lizin.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	S6297
Hidroksilamin	Sigma-Aldrich	159417
Sodyum hidroksit	Merck	106498
AF594 succinimidyl esterleri	Moleküler Problar, Invitrogen	A20004
PD-10 sütun	GE Healthcare	17-0851-01
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
M-199	Invitrogen	11150
FBS	Hyclone	SH30070.03
4-plaka	Nunc	176740
Lameller	Einst	0111520
Mikroskop lamı	Marka Yelken	7105
3H5 hibridoma	ATCC	HB46
10x PBS	1. Tabanı	BUF-2040-10X1L
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Magnezyum klorür	Sigma-Aldrich	M2670
Kalsiyum klorür	Sigma-Aldrich	C3306
Paraformaldehye	Sigma-Aldrich	15,812-7
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904
Dabco	Sigma-Aldrich	D27802
Masa üstü santrifüj	Eppendorf	5424
Konfokal mikroskop	Zeiss	EKK 710