GENPLAT (GLBRC Enzim Platformu) biyokütle bozulması için enzim kokteyller keşif ve optimizasyonu için otomatik bir platform. Bu birden fazla hammadde ve birden fazla bileşen içeren enzimlerin karışımları adapte edilebilir.
Yöntem makalesi
GENPLAT: Biyokütle Enzim Discovery ve Kokteyl Optimizasyonu Otomatik Platform
Bu makalede
Özet
Özet
Biyokütle yıkımı için kullanılan enzimlerin yüksek maliyeti, lignoselülozik hammaddelerin etanol gibi sıvı taşıma yakıtlarına ekonomik dönüşümünün önündeki temel bir engeldir. Çeşitli ön işlem/biyokütle kombinasyonlarından şekerlerin salınımı için yeni enzimlerin ve enzim kokteyllerinin keşfi ve geliştirilmesi amacıyla GENPLAT adı verilen entegre, yüksek verimli bir platform geliştirdik. GENPLAT dört unsurdan oluşur: bireysel saf enzimler, deneylerin istatistiksel tasarımı, biyokütle bulamaçlarının ve enzimlerin robotik pipetlemesi ve salınan Glc ve Xyl'in otomatik kolorimetrik tayini. Bireysel enzimler, Pichia pastoris veya Trichoderma reesei içinde ekspresyon yoluyla ya da ticari kokteyllerden veya yeni mikroorganizma ekstraktlarından kromatografik saflaştırma ile üretilir. Simplex lattice (fraksiyonel faktöriyel) karışım modelleri, ticari Deney Tasarımı istatistiksel yazılımları kullanılarak tasarlanır. Yüksek karmaşıklıktaki enzim karışımları, 96 kuyucuklu formata robotik pipetleme yapılarak oluşturulur. Salınan Glc ve Xyl ölçümü, enzim bağlı kolorimetrik assayler kullanılarak otomatikleştirilmiştir. 16 bileşene kadar çıkan optimize edilmiş enzim karışımları, çeşitli hammadde ve ön işlem kombinasyonları üzerinde test edilmiştir.
GENPLAT; saf enzim karışımlarına, ticari ürün karışımlarına (örneğin, Accellerase 1000 ve Novozyme 188), yeni mikropların ekstraktlarına veya bunların kombinasyonlarına uyarlanabilir. Son toplam yükleme 15 mg protein/g glukan olarak çalışıldığında, ˜10 saf enzimden oluşan karışımların hazırlanması ve test edilmesi için her bir proteinden 100 μg'dan daha az ve toplamda 100'den az reaksiyon gerekir. Çeşitli kaynaklardan enzimler kullanıyoruz. Enzimler, fungal kültürler (örneğin, Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum ve Galerina marginata) gibi doğal kaynaklardan saflaştırılabilir veya kodlayan genlerin (artan sayıdaki mikrobiyal genom dizilerinden elde edilen) E. coli, Pichia pastoris gibi konaklarda veya T. reesei gibi bir filamanöz mantarda ekspresyonu ile üretilebilir. Proteinler ayrıca ticari enzim kokteyllerinden (örneğin, Multifect Xylanase, Novozyme 188) de saflaştırılabilir. Glikozil hidrolazlar, hücre duvarı aktif esterazlar, proteazlar ve liyazlar dahil olmak üzere artan sayıda saf enzim; Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) ve PROZOMIX (www.prozomix.com) gibi ticari kaynaklardan temin edilebilmektedir.
Simpleks-kafes tasarımları oluşturmak ve yanıtları (bu durumda, Glc ve Xyl salınımını) analiz etmek için Design-Expert yazılımı (Stat-Ease, Inc.) kullanılır. Karışımlar, oranları %0 ile %100 arasında değişebilen 4-20 bileşen içerir. Analiz noktaları tipik olarak, geçerli bir model oluşturmak için yeterli sayıda ara nokta ile birlikte uç köşeleri içerir. Deneysel tasarım terminolojisinde, çalışmalarımızın çoğu, tüm bileşenlerin toplamının sabit bir toplam protein yüklemesine (mg/g glukan olarak ifade edilir) eşit olduğu "karışım" deneyleridir. Simpleks-kafesteki karışım sayısı, hem karışımdaki bileşen sayısına hem de polinom derecesine (kuadratik veya kübik) bağlıdır. Örneğin, üçlü etkileşimleri tespit edebilen artırılmış özel kübik modelle yapılan 6 bileşenli bir deney 63 ayrı reaksiyon gerektirirken, artırılmış kuadratik modelle yalnızca 23 münferit reaksiyon yeterlidir. Sekizden fazla bileşen içeren karışımlar için kuadratik deneysel tasarım daha pratiktir ve deneyimlerimize göre bu tür modeller genellikle istatistiksel olarak geçerlidir.
Tüm enzim yüklemeleri, nihai toplam yüklemenin bir yüzdesi olarak ifade edilmiştir (ki bu bizim deneylerimiz için tipik olarak 15 mg protein/g glukan'dır). "Çekirdek" enzimler için alt yüzde sınırı %5 olarak belirlenmiştir. Bu sınır, herhangi bir çekirdek enzimin %0 oranında olduğu durumlarda Glc ve/veya Xyl verimlerinin çok düşük olduğu deneyimlerimize dayanarak türetilmiştir. Çok fazla örneğin çok düşük Glc veya Xyl verimleri göstermesi, yetersiz modellere yol açar. Bir alt sınır belirlemek, buna bağlı olarak bir üst sınırı da belirler. Yani, altı bileşenli bir deneyde, her bir tekil bileşen için alt sınır %5 olarak belirlenmişse, her bir tekil bileşenin üst sınırı %75 olacaktır. "Yardımcı" olarak değerlendirilen diğer tüm enzimlerin alt sınırları %0 olarak belirlenmiştir. "Çekirdek" ve "yardımcı" ifadeleri bir dereceye kadar keyfi tanımlamalardır ve substrata göre farklılık gösterecektir; ancak çalışmalarımızda mısır sapından Glc salınımı için çekirdek enzimler, T. reesei'den şu enzimleri içerir: CBH1 (Cel7A olarak da bilinir), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glukozidaz), EX3 (endo-β1,4-ksilanaz, GH10) ve BX (β-ksilozidaz).
Protokol
1. Enzim Üretimi
- PPICZ veya pPICZα vektörler ilgili genlerin klonlanması ve P. dönüşüm Pichia pastoris proteinlerin üretin pastoris. Metanol indüksiyonu ile şaşkına 500 ml'lik şişeler içinde 300 ml gruplar halinde hücrelerin büyümesine, her 24 saat (Banerjee ve ark, 2010a).
- Konsantre ve teğetsel akış filtrasyon ile kültür filtratlar desalt.
- -80% 20 gliserol küçük alikotları enzimler Mağaza ° C Mg / ml konsantrasyon aralığında 1-10.
2. Deney Tasarımı
- Giriş test enzimlerin sayısı, üst ve daha düşük oranlarda (çekirdek enzimler için% 5 daha düşük bir oranda) ve deneysel tasarım Tasarım Expertsoftware içine türü (örneğin, kuadratik veya kübik).
- 15 mg / g glukan toplam yükleme yapmak eklenecek her enzim mikrogram miktarını hesaplayın ve sonra eklemek için ul her bir enzimin miktarını hesaplamakHer reaksiyon.
- Excel çalışma sayfaları, deneysel tasarım ve Biomek FXP yazılım aktarmak dosya transferi işlevini kullanarak göre su ve enzimler dağıtımı için kaynak Laboratuvar, kaynak kuyuları, hedef Laboratuvar, hedef kuyuları, ve transfer birimleri belirterek oluşturun.
3. Enzimatik Hidroliz
- Raketi rezervuar, 5 mg / ml tetrasiklin ve 5 mg / ml Siklohekzimidsiz içeren 50 mM sodyum sitrat, pH 4.8 biyokütle bulamaç askıya alınması.
- 96-kuyu derin kuyu reaksiyon plakaların her kuyuya bulamaç robot pipetlemeyin 200 ul Açıklığı-8 kesilmiş son 0.5 cm ile 1000-ul pipetlemeyin ipuçları. 100 ul / sn bulamaç kez karıştırın ve daha sonra aynı kürek rezervuar hacmi aspirat ve tabak içine dağıtmak.
- Beckman FX girilen programını kullanarak aynı plaka enzimler koyun.
- Delinebilen capmats plakaları.
- Ters çevirin ve dokununplakaların yüzey gerilimi aşmak için birkaç kez. 50 ° C'de 48 saat süreyle 10 rpm'de melezleşme inkübatör dönen plakalar yerleştirin.
4. GLC ve Xyl Belirlenmesi
- Sallanan bir kova santrifüj 1250 xg az 3 dakika için reaksiyon plakaları santrifüjleyin.
- 100 ul süpernatantı Biomek FX AP96 bölmesini kullanarak düzenli 96-kuyucuğu içine aktarın.
- 90-95 az plakalar ° C'de enzimleri inaktive ve daha sonra 30 sn için 1250 xg'de santrifüj için 10 dk.
- GLC ölçümleri için, düzenli olarak 96-kuyucuğu süpernatantlar 12 ul aktarın. Glukoz oksidaz / peroksidaz (GOPOD) reaktif 192 ul ekleyin. Plakalar için 50 ° C'de 20 dakika inkübe edin ve bir mikroplak okuyucu 510 nm de absorbans okunur. Boş hiçbir enzim ile reaksiyona karışımıdır.
- Xyl ölçümleri için, 384-kuyucuğu 4 ul transfer. Tahlil reaktifler ve 340 nm'de plakaları okuyun. Boşhiçbir enzim reaksiyon karışımı.
5. Veri Analizi
- Absorbans değerleri bilinen GLC ve orijinal biyokütle Xyl içeriği temel alarak% GLC ve Xyl verim dönüştürün. Tasarım Uzman yazılımı tepkiler olarak bu yüzdeler içe aktarın. Istatistiksel paramenters sağlam bir model için kriterleri yerine getirmiş olduğundan emin olmak için kontrol edin.
- Deneysel olarak en iyi modeli tahmin onaylayın.
6. GENPLAT Temsilcisi Sonuçlar:
(1) bireysel saf proteinlerin optimize edilmiş bir karışım oluşturulması. Sonuçları enzimler önemli olduğu ve hangi oranlarda, hangi enzimlerin önemli değildir . T. bol Bazı proteinler Cip1 ve Cip2 reesei secretome (Nagendran ve ark, 2009), amonyak fiber genişleme (AFEX) ya da alkalin HYD tarafından tedavi öncesi mısır koçanı GLC sürümde hiçbir rol oynadığı görülmektedir oksidatif stresin (AHP) (Banerjee ve ark, 2010b). Öte yandan, bazı proteinler beklenmedik önemlidir. Örneğin, 10 ve 11 glikozil hidrolaz aileleri endo-xylanases GLC serbest bırakılması için iki önemli olan bir xylanase diğer (. Banerjee ve ark, 2010b, c) yerini alamaz. T., küçük bir protein Cel61A reesei secretome GLC için çok önemli ama serbest Xyl değil. Bazı enzimler ise diğerleri sadece birini ya da diğerini (Banerjee ve ark. 2010C) için gerekli, hem de GLC ve Xyl serbest bırakılması için önemlidir.
16 bileşenler, her bir konsantrasyon 0.94 mg / ml (yani, olmayan bir optimize karışımı) içeren bir sentetik karışım, AFEX önceden tedavi DDG kullanılabilir GLC% 38'i piyasaya sürdü. , Aynı hidroliz koşullar altında, optimum bir karışım, 16 bileşenlerin konsantrasyonları,% 0 ile%% 32 arasında değişmektedir (Şekil 2)% 52 GLC yayınladı. Bu deney tanımlanan karışımları inşa yararını göstermektedir.
_content "farklı tedavi öncesi / substrat kombinasyonları için en uygun kokteyller> (2) Yaratılış Mevcut ticari selülaz hazırlıkları" tek tip uyan tüm "Gerçekte, en iyi kokteyl substrat ve tedavi öncesi hem de bağlıdır. tek bir ürün Accellerase 1000, farklı yüzeyler, aynı şekilde ön işlem ve farklı ön işlemleri (Şekil 1) maruz aynı substrat farklı verim verir gibi birden fazla ön işlemleri ve mutiple hammadde (Banerjee ve saf enzimlerin karışımlar optimize etmek için GENPLAT kullanmış ve arkadaşları, 2010C). Şekil 2 16 saf enzimlerin optimal enzim oranlarda ön tedavi-AFEX mısır koçanı, AHP-tedavi öncesi mısır koçanı ve AFEX ön tedavi DDG için nasıl farklı olduğunu gösterir. Sadece 11 enzimler Şekil 2 çünkü optimal diğer beş (Cel61B AbfB, Cip1, Cip2 ve Cel12A) oranları% 0 olarak bulundu (Banerjee ve ark. 2010C).(3) Roman enzim keşif T. daha özleri yaptık reesei ve A. Nijer farklı yüzeyler üzerinde büyüdü. Temel eklendiğinde belirli bir özü GLC verimi artırdı. Sorumlu proteinin saflaştırılmış ve bir roman glikozil hidrolaz (Banerjee ve Walton, yayınlanmamış sonuçlar), herhangi bir ticari enzim hazırlık mevcut değil olduğu gösterilmiştir.
Daha iyi enzimler (4) Discovery. Bir bozulma enzimlerin en önemli GENPLAT ile gösterilir.Özellikle biyokütle, enzimler iyileştirilmesi için odak noktası olması gereken daha iyi bir anlayış var. Kritik enzimler daha iyi örnekler doğada arayarak ya da protein mühendisliği tarafından yapılmış olabilir. (Bir enzim istenilen özelliğine bağlı olarak çeşitli şekillerde T. reesei homolog, daha "iyi" olabilir, örneğin, yüksek spesifik aktivite, daha fazla sinerji, proteolitik hassasiyet, veya gelişmiş termal stabilite azalma). Saf selüloz veya diğer yapay substratlar sonuçlar doğal lignocellulosic ile ilgili olmayabilir, çünkü gerçekçi karmaşık bir kokteyl (biyokütle enzim izolasyon çalıştığı için önemli) ve önemli gerçekçi bir substrat (kullanır, çünkü GENPLAT, potansiyel olarak daha iyi enzimler assaying için anlamlı bir platform sağlar malzemeler).
(5) Ticari enzim optimizasyonu. Yeterince büyük miktarlarda saf enzimlerin henüz gerçek dünyada yok. Yapıncaya kadar, etanol producers gibi Accellerase 1000 ve MultifectXylanase gibi ticari ürünler güvenmek gerekir. Ancak, ticari enzimler karışımları genellikle herhangi bir birey daha iyi performans ve GENPLAT birden fazla ticari enzimlerin optimize kokteyller tasarım için kullanılabilir. Şekil 3, dört ticari enzim preparatları bir karışımı optimize etmek için GENPLAT kullanımı gösterir. AFEX ön tedavi DDG GLC serbest bırakılması için en uygun oranlarda,% 47 Accellerase1000,% 27,% 22 Multifect Pektinaz Novozyme 188 ve% 4 Multifect xylanase (Banerjee ve ark. 2010C) olarak bulunmuştur. Şekil 3B dört enzim preparatları ile AFEX-DDG GLC verim arasındaki farklılıklar gösterir; optimize edilmiş ticari karışımı yüksek GLC verim verir, tek başına Accellerase1000 daha SpezymeCP tek başına veya bir 16-bileşenli sentetik karışım. Bu deney aynı zamanda 16-bileşenli sentetik karışımı için gerekli ticari enzimlerin bir veya daha fazla mevcut en iyi GLC açıklaması, bir veya daha fazla enzimler eksik olduğunu gösterir. GENPLAT bize.ed gibi bileşenler tespit etmek.
Şekil 1: Tek başına hiç bir ticari enzim hazırlık tüm yüzeyleri ve tüm ön işlemleri için en uygunudur. Beş yüzeyleri ve taşlama (0.5 mm parçacık boyutu) benzer koşullar altında üç ön işlemleri karşılaştırıldığında, enzim yükleme (15 mg / g glukan) ve hidroliz koşulları (48 saat, 50 ° C) farklı AFEX ön işlem substratlar A. Sindirim Accellerase 1000 ile mısır koçanı B. Sindirim Accellerase 1000 ile üç farklı yöntem (Banerjee ve ark. 2010C) ile ön işlem.
Şekil 2 AFEX-tedavi öncesi mısır koçanı (AFEX CS), alkalin hidrojen peroksit tedavi öncesi mısır koçanı (AHS-CS), ya da kurutulmuş AFEX ön tedavi GLC serbest bırakılması için 11 enzimlerin optimal oranlarda damıtmakers 'tahıl (AFEX DDG). Veriler Banerjee ve ark.. (2010C). Çubukların üstündeki sayıları, toplam GLC biyokütle örnek bir yüzdesi olarak GLC verim.
Şekil 3. A. AFEX-ön tedavi DDG GLC serbest bırakılması için dört ticari enzim preparatları optimize edilmiş bir karışımı üretmek için GENPLAT kullanın. Multifect xylanase en küçük katkısı (% 4) ve bu nedenle bu üçlü diyagram atlandı. Özdeş hidroliz (15 mg / g glukan enzim, 48 saat, 50 ° C) koşulları altında farklı enzim tedaviler ile B. AFEX-DDG GLC verimleri . "Dört bileşenli ticari" Şekil deney belirlenen oranlara sahiptir. 3A.
Tartışma
Bu yaygın enzimlerin maliyetini azaltarak ekonomik bir lignocellulosic etanol endüstrisinin gelişimi için önemli olduğu kabul edilmektedir. Şu anda mevcut ticari enzim kokteyller birçok proteinleri (Nagendran ve ark, 2009) karmaşık ve kötü tanımlanmış karışımları ve özellikle asit-tedavi öncesi mısır koçanı kullanmak için uyarlanmıştır. Daha iyi enzim kokteyller gelişimini hızlandırmak için, bazı laboratuvarlar enzim keşif ve karakterizasyonu için yüksek verimli platformlar geliştirdik. Decker et robot, enzimler ve biyokütle çamurlar dağıtım, istatistiksel deney tasarımı ve / veya otomatik olarak belirlenmesi GLC ve Xyl (Berlin ve ark, 2007: Bu alandaki çabalar da GENPLAT bulunan aşağıdaki özelliklerden bir veya daha fazla dahil diğerleri, 2009; Kim ve ark, 1998; King ve ark, 2009). GENPLAT en az 6 bileşenleri analiz edilebilir enzim karışımlarının karmaşıklığı en önemlisi, bu daha önceki çabaları uzanıren son çalışma fazla 16 daha önceki çalışmalarda (Banerjee ve ark. 2010C). Üzerinde uç uç dönme sindirim sırasında nazik karıştırma; ve Glu ve Xyl otomatik kolorimetrik tespiti GENPLAT Ek temel özellikleri, dağıtım sırasında askıya koçanı çamurlar tutabilir boncuk karıştırma haznesinin kullanımı (kürek rezervuar).
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma, ABD Enerji Departmanı, Temel Enerji Bilimler, Bölüm Dairesi, ABD Enerji Great Lakes Biyoenerji Araştırma Merkezi Departmanı (DOE Bilim BER Office DE-FC02-07ER64494) ve hibe DE-FG02-91ER200021 tarafından finanse edildi Kimyasal Bilimler, Yer Bilimleri ve Biosciences. John Scott-Craig ve Melissa Borrusch Biz onların maddi ve kavramsal katkıları için teşekkür ederim.
Malzemeler
Kullanılan araç ve gereçler ve yazılım:
- Tasarım Uzman yazılım, Sürüm 8.0 (Stat-kolaylığı, Inc, Minneapolis, MN) ( http://www.statease.com )
- Biomek FXP laboratuvar otomasyon iş istasyonu (Beckman Coulter, Fullerton, CA)
- Biomek FXP yazılımı, Sürüm 3.3 (Beckman Coulter, Fullerton, CA)
- Paddle rezervuar (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc, San Diego)
- Tabaklar, 96-derin (1,5 ml) (Abgene, Fisher Scientific, Epson, Birleşik Krallık)
- Delinebilen capmats (ABD Bilimsel, Ocala, FL)
- Döner melezleşme inkübatör (Model 5420, VWR)
- Sallanır kovası santrifüj (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Almanya)
- Tabaklar, Costar 96 (Abgene, Fisher Scientific, Epson, İngiltere)
- Tabaklar, 384-(BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)
Reaktifler kullanılır:
- Pichia pastoris ve vektörler: suşu X33 ve pPICZ ve pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA)
- T. reesei ve vektörleri: suşu QM9414 (ABD Dışişleri Bakanlığı Tarımsal Kullanımı Ulusal Tarım Araştırma Merkezi, Peoria, IL) ve pCB1004-EV (Banerjee ve ark, 2010b)
- Accellerase 1000 (lot numarası 1600844643) (Genencor, Inc, Rochester, NY)
- 50 mM sodyum sitrat tamponu, pH 4.8
- Tetrasiklin stok: 10 mg / ml
- Cycloheximide stok: 10 mg / ml
- GOPOD testi kiti, katalog K-GLUC (Megazyme, Bray, İrlanda)
- Ksiloz testi kiti, katalog K-ksiloz (Megazyme, Bray, İrlanda)
Kaynaklar
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. , 2nd Edition, Productivity Press. New York. (2007).
- Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Aslam, N., Walton, J. D. Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: production and optimization of a core set. Biotechnol. Bioengineer. 106, 707-720 (2010).
- Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Bongers, M., Walton, J. D. Synthetic multi-component enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass. Bioresour. Technol. 101, 9097-9105 (2010).
- Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Walton, J. D. Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment/biomass feedstock combinations. Biotechnol. Biofuels. 3, 22-22 (2010).
- Berlin, A., Maximenko, V., Gilkes, N., Saddler, J. Optimization of enzyme complexes for lignocellulose hydrolysis. Biotechnol. Bioeng. 97, 287-296 (2007).
- Decker, S. R., Brunecky, R., Tucker, M. P., Himmel, M. E., Selig, M. J. High throughput screening techniques for biomass conversion. Bioenerg. Res. 2, 179-192 (2009).
- Gao, D., Chundawat, S. P., Krishnan, C., Balan, V., Dale, B. E. Mixture optimization of six core glycosyl hydrolases for maximizing saccharification of ammonia fiber expansion (AFEX) pretreated corn stover. Bioresour. Technol. 101, 2770-2781 (2010).
- Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Poulsen, J. C. N., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S. Y., LoLeggio, L. Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: Structure and function of a large, enigmatic family. Biochemistry. 49, 3305-3316 (2010).
- Kim, E., Irwin, D. C., Walker, L. P., Wilson, D. B. Factorial optimization of a six-cellulase mixture. Biotechnol. Bioeng. 58, 494-501 (1998).
- King, B. C., Donnelly, M. K., Bergstrom, G. C., Walker, L. P., Gibson, D. M. An optimized microplate assay system for quantitative evaluation of plant cell wall-degrading enzyme activity of fungal culture extracts. Biotechnol. Bioeng. 102, 1033-1044 (2009).
- Nagendran, S., Hallen-Adams, H. E., Paper, J. M., Aslam, N., Walton, J. D. Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei. Fung. Genet. Biol. 46, 427-435 (2009).
- Rosgaard, L., Pedersen, S., Langston, J., Akerhielm, D., Cherry, J. R., Meyer, A. S. Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulase mixtures on differently pretreated barley straw substrates. Biotechnol. Prog. 23, 1270-1276 (2007).
Yeniden basım ve izinler
