Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Summary

Oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanarak bir örnek içinde mikroorganizmaların tespiti için çoklama yöntemi açıklar. Bir örnek içindeki tüm organizmalar Amplikon bir panel prob-çiftli boncuk melezleşmiştir. LUMINEX veya Bio-Plex enstrüman, boncuk, boncuk türü ve hibridizasyon sinyali için her bir sorgu için kullanılır.

Abstract

Bakteriyel vajinozis (BV), "normal" Mikrobiyota Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae de dahil olmak üzere çok sayıda bakteri türlerinin hakim olduğu bir Mikrobiyota ^{Lactobacillus-egemen,} ve diğerleri 1-3 bir değişiklik ile karakterize tekrarlayan polimikrobiyal bir sendromdur. Bu durum, HIV satın ^alma 4 de dahil olmak üzere, olumsuz sağlık sonuçları, bir dizi ile ilişkili olup, ^klinik olarak 5 yönetmek için zor olabilir. Ayrıca, BV tanısı, çeşitli sayısal ^kriterleri 6,7 puan vajinal sürüntü smear Gram boyama güvendi . Bu tanı, basit, ucuz ve kaynak sınırlı ayarları iyi uygun olmasına rağmen, sübjektif ve vajinal Mikrobiyota ⁸ kompozisyon ayrıntılı bir profilini vermez sorunları muzdarip olabilir. Yeni derin sıralama çabaları ile zengin, çeşitli vajinal Mikrobiyota ortaya koymuşturbir dizi BV ^11,12 moleküler tanı için potansiyel hedefler belirlenmesi sonuçlandı Normal ^9,10 olarak bireylere kıyasla BV tanısı kişilerden alınan örnekler arasında belirgin farklılıklar. Bu çalışmalar yararlı bilgiler bir zenginlik var, ama derin sıralama henüz klinik bir ortamda bir tanı yöntemi olarak pratik değildir. Biz son zamanlarda hızla LUMINEX ^platformu 13 algılama oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanılarak, çok katlı bir biçimi vajinal Mikrobiyota profil için bir yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntem, mevcut Gram boyama tabanlı yöntemler gibi basit ve hızlı ama prob tasarım çalışmaları sıralama kaynaklanan moleküler bilgi sömürmek için ek bir avantaj katıyor. Bu yöntem, bu nedenle, BV, spesifite ve duyarlılığı yüksek comp ile teşhis etmek için kullanılabilecek bir vajinal sürüntü bulunan önemli mikroorganizmalar profil bir yol sağlaryarı-kantitatif ve hızlı bir şekilde türlerin varlığı ve bolluk hakkında ek bilgi sağlarken Gram boyama ared. Bu çoklama yöntemi, şu anda tek ^bir örnek 14 5 veya 6 farklı deneyleri ile sınırlı belirli organizmalar için geçerli kantitatif PCR testleri aralığının dışında genişletilebilir. Önemlisi, bu yöntem vajinal bezlerden bakteri tespit sınırlı değil ve hızla ilgi hemen hemen her mikrobik bir topluluk profil kolayca adapte edilebilir. Örneğin, son zamanlarda, atıksu arıtma tesislerinde kullanım için tanı araçları geliştirme metodolojisini uygulamak için başladı.

Protocol

Bu yöntem Dumonceaux ark bildirilen araştırma kullanılmıştır. J. Clin. Microbiol 47, 4067-4077, DOI: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Genel prosedürü anlatan şematik diyagramı Şekil 1'de sunulmaktadır.

1. Boncuk kaplin

(Bkz. Tablo 2) polistiren LUMINEX boncuk oligonükleotid problar kaplin için kullanılacak yöntemler açıklanmıştır. Hacimler yeni yakalama probları bir deneme olarak değerlendirilmesi için biraz adapte; bu miktarlar parantez içinde belirtilmiştir.

1. -20 ° C desikatöre 1-Etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) toz çıkarın ve oda sıcak....

Discussion

Özgüllük sinyal nesil kritik öneme sahiptir; sinyal gerçekten, o organizmanın elde Amplikon tespiti yansıtan gözlenen emin olmak gerekir. Yazılım PrimerPlex (Premier Biosoft) gibi verimli bir melezleşme olan problar tasarım için yardımcı olabilir, ancak kendilerinin veya hedef olmayan türler çapraz melezleşme değil olabilir. Bu protokol evrensel PCR primerleri açıklandığı gibi kullanıldığı zaman, üretilen Amplikon örnek mevcut organizmaların tümünü temsil ettiğini akılda tutmak önemlidir. CpnDB cpn60 UT diziler.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonükleotid adı	Şirket	Sıra 1
H279BP	Invitrogen, IDT, ya da diğer	Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
1O, phosphorothioate-C, E, phosphorothioate-G, F, phosphorothioate-A, I, inozin Y, C veya T, R, A ya da G, K, T, G, S, C veya G.

Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1-Etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC)	Delmek	22980
Floresan polistiren boncuklar: MicroPlex Mikroküreler (LUMINEX), ya da Bio-Plex COOH Boncuk (Bio-Rad)	LUMINEX veya Bio-Rad	Bio-Rad: 171-506xxx xxx boncuk tanımlayıcı tekabül	Manyetik boncuk oligonükleotid bağlamak için kullanılabilir hale geliyor ve bazı avantajlar sunabilir. Bu yazarlar tarafından denenmiş değil.
Yakalama oligonükleotidler (5 'amino C12 modifiye)	Invitrogen, IDT, ya da diğer	çeşitli	Desalted saflık derecesi kabul edilir. Vajinal bezlerden karakterize etmek için kullanılan yakalama probları dizileri, bu protokolü 13 dayandığı el yazması sağlanır .
T7eksonükleaz	New England Biolabs	M0263S
Streptavidin-R-fikoeritrin (SA-PE)	Invitrogen	S-866	Yüksek saflıkta SA-PE elde etmek için dikkatli olun; bu katalog numarası önerilir.
Termo 96 PCR plakaları	Balıkçı	CS006509	96-iyi PCR ve Bioplex makine sığacak
Termo sızdırmazlık mat	Balıkçı	CS006555	Yeniden kullanılabilir; sabunlu su ile yıkayın, iyice durulayın ve kuru
5M TMAC	Sigma	T3411
Bio-Plex veya LUMINEX aracı	Bio-Rad veya LUMINEX	Bio-Rad: 171-000201
Prob tasarım PrimerPlex yazılımı	Premier Biosoft	www.premierbiosoft.com	LUMINEX prob de için önerilendiğer yazılım platformlarında kullanılan olsa da, işaret

bileşen	ul / tahlil	μl/100 deneyleri	nihai konsantrasyonu
10x PCR buffer (Invitrogen)	5	500	1x
50 mM MgCl 2 (Invitrogen)	2,5	250	2.5 mM
10 mM dNTP	1	100	Her biri 0.2 mM
H279BP, 25 mcM	0,25	25	375 nM
H1612BP, 25 mcM	0,75	75	125 nM
H280, 25 mcM	0,25	25	375 nM
H1613,25 mcM	0,75	75	125 nM
Su	34	3400	---
Toplamları	44,5	4450