Method Article

Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII

DOI:

10.3791/3362

⸱

January 30th, 2012

 , 
1Department of Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M University System Health Science Center, College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz canlı manikür görselleştirmek için bir yöntem mevcut C. elegans Yaygın olarak kullanılan kırmızı floresan lipofilik boya DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat) C. elegans Çevreye maruz kalan nöronlar görselleştirmek. Alae ve halkalı cuticular yapılar optimize edilmiş bu protokol ile, DII tarafından boyanmış ve bileşik mikroskobu kullanarak gözlenen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. kütikül elegans hayvan 1-4 dış çevreler son derece dayanıklı bir yapıdır . Manikür hayvan çevreden korur, aynı zamanda vücut şekli belirler ve motilitesi 4-6 önemli bir rol oynar sadece. Epidermal hücreler tarafından salgılanan çeşitli katmanları bir dıştaki lipit tabaka 7 de dahil olmak üzere, manikür oluşmaktadır.

Dairesel sırtlar manikür annuli desen hayvan uzunluğu olarak adlandırılır ve geliştirme 8 tüm aşamalarında bulunmaktadır. Alae Belirli gelişim aşamaları sırasında L1, Dauer ve yetişkin aşamaları 2,9 de dahil olmak üzere mevcut çatılar. Cuticular kollajen organizasyonu etkileyen genlerindeki mutasyonlar cuticular yapısı ve hayvan vücut morfolojisi 5,6,10,11 değiştirebilir. Cuticular yapıları Fluores, cuticular görüntüleme DIC optik ile bileşik mikroskobu kullanarak vurgulamak mümkün, güncel yöntemleryüzde transgen ifade 12, antikor boyama 13 ve elektron mikroskobu 1. Etiketli buğday tohumu agglutinin (WGA) cuticular glikoproteinler görselleştirmek için kullanılan, ancak daha ince cuticular yapılar 14 çözümünde sınırlıdır. Floresan boya kullanarak cuticular yüzey boyama gözlenmiş, ancak ayrıntılı 15 hiç karakterize olmuştur. Biz canlı C. manikür görselleştirmek için bir yöntem mevcut kullanarak elegans, yaygın olarak C. kullanılan kırmızı floresan lipofilik boya DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat ) elegans çevreye maruz kalan nöronlar görselleştirmek için. DII boyama için optimize edilmiş Bu protokol, yüksek çözünürlüklü floresan annuli görselleştirme, alae, vulva, erkek kuyruk ve C hermafrodit kuyruk başak için basit, güçlü bir yöntemdir elegans.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hazırlık DII, leke

  1. DMF 20 mg / ml DII (Biotium, Inc, Hayward, CA) stok solüsyonu hazırlayın. DII ışığa karşı hassastır, bu yüzden folyo sararak ışık DII korumak.
  2. 0.6 mcL DII stok her nüfus için 399,4 mcL M9 ekleyerek DII bir çalışma seyreltme oluşturun. Bu son bir çalışma seyreltme 30 mcg / ml DII M9 vermelidir. Bu, aynı anda birden fazla popülasyonlar boyama için ölçeklendirilebilir. Kalkan DII tüp (ler) folyo sararak ışık.

2. Nematod hazırlanması

  1. Kirlenmemiş nematod bir nüfusu içeren 60 mm levha kullanın. Tüm larva ve yetişkin hayvanların yavaşça gevşetin plaka yüzey üzerinde dairesel bir hareket....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan DII boyama yöntemi C. elegans manikür görselleştirmek için oldukça hızlı ve rahat bir şekilde sağlar . Repurposing ve optimize ederek, yaygın olarak görüntü çevreye maruz duyusal nöronlar 15,17 kullanılan bir yöntemdir, DII floresan alae ve halkalı yapılar (Şekil 1 ve 2), yanı sıra vulva, erkek kuyruk ve hermafrodit kuyruk başak leke için kullanılabilir (Şekil 3). Biz DII yeteneği inkübasyon çözüm ve zaman etkisi sürekli manikür (Tablo 1, Şekil 4) leke bulduk. DII boyama çevreye maruz .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, ve HC teşekkür etmek istiyorum. Yararlı tartışmalar için Hsiao. Bu çalışma, Moleküler Tıp TAMHSC Anabilim Dalı start-up fonları tarafından finanse edildi. Bileşik kapsamı ve dönen disk departmanı ve TAMHSC Dekan Ofisi tarafından sağlanan fonlar ile satın alındı. Bazı suşlar, Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından verilmiştir . pRF4 (rol-6 (su1006)) A. Ateş bir hediye oldu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktifler Eşanlamlılar Şirket Katalog numarası Yorumlar
DII 1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat Biotium, Inc. 60010 Stok seyreltme:
DMF 20 mg / ml
çalışma seyreltme: 30 mg / ml
DMF Dimethylformamide Sigma-Aldrich, Inc. D4551
Triton
X-100 		Octylphenoxypolyethoxyethanol VWR International, LLC. EM-9410
M9 22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm NaCl, 1mm MgSO 4
NGM Nematodu büyüme ortamı IPM Scientific, Inc. 11006-501 18 NGM agar protokol hazırlanmış olabilir
Agar-agar Merck Kimyasallar, Inc. 1,01614 % 4 su
Levamizol Levamizol hidroklorür Sigma-Aldrich, Inc. 31742 100 mcM - 1 mM levamizol gerektiği gibi
Mikroskop slaytlar VWR International, LLC. 16005-106
Mikroskop kapak camları VWR International, LLC. 16004-302
Bileşik kapsamı Carl Zeiss, Inc. A1M Deney ihtiyaçlarına uygun hedefleri kullanın
TRITC veya diğer uyumlu filtre   Chroma Technology Corp. 49005 ET - DSRed (TRITC/Cy3) filtre seti Püskürtülen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
  2. Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C elegans CuticleDiI StainingFluorescent DyeCuticle VisualizationNematode StainingAnnuli AlaeFluorescence MicroscopyLipophilic DyeCuticle StructureLive Imaging

Related Articles